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第一部分跨表皮失水对皮肤表皮细胞基因表达的影响目的：研究皮肤表皮在失水状态下其基因表达的变化,为探索皮肤瘢痕的形成机制提供研究基础。方法：在兔耳动物模型中,通过半封闭辅料(Tegaderm)覆盖兔耳皮肤栅格状切口创面,模拟创面愈合的不同湿润条件,其中直接暴露于空气中的为失水组,用四层Tegaderm覆盖的为对照组。比较失水组与对照组在创面愈合后瘢痕形成的情况：并利用基因芯片技术分析在不同条件的愈合,其表皮细胞的基因表达情况,寻找出在不同湿润条件下愈合时表皮细胞基因表达的差异,在进行功能性分类后,对其中主要与炎症反应有关的基因进行分析；且在人断层皮片体外培养(HESC)模型和复层表皮细胞培养(SKC)模型中,通过表皮组织或细胞暴露空气或是浸入培养基模拟表皮的不同湿润状态,通过实时定量PCR技术分析人表皮组织中上述炎症因子基因的表达,也发现其在失水组呈现明显的升高；另外通过慢病毒RNA干扰(RNAi)技术研究这些炎症因子之间的相互关系,为探明失水状态下皮肤瘢痕愈合发生机制提供线索。结果：兔耳创面在不同的湿润条件下愈合,其愈合进展有一定的差别,失水组较对照组愈合减慢,愈合后其表皮组织增厚；两组间表皮细胞基因的表达表现出很大的差异,有大量基因在失水组的表皮组织中呈明显升高趋势,其中与炎症有关的基因：IL-1β、IL-8、TNF-α、COX-2及S100A8、 S100A9的基因表达在未应用Tegaderm覆盖的失水组呈明显升高；同时,在HESC模型及SKC中,失水状态也会使人表皮细胞中这些促炎因子的表达升高；利用慢病毒RNAi技术分析各炎症因子间的关系表明：在表皮失水状态下,表皮细胞中的IL-1β、TNF-α可通过不同的途径调节IL-8的表达,其中COX-2介导了TNF-α对IL-8的调节；表皮中IL-8的升高可以进一步调节基质金素蛋白酶-9(MMP-9)的表达。结论：在创面愈合后,表皮的湿润状态可影响表皮组织的炎症因子的表达,进而可能会对瘢痕的形成产生影响。第二部分S100A8/A9在表皮细胞中的表达及其介导失水状态下皮肤成纤维细胞的活化目的：研究皮肤失水状态下表皮细胞中S100A8/A9的表达,及其与皮肤成纤维细胞的活化及瘢痕形成之间的关系。方法：通过免疫荧光染色分析对比增生性瘢痕及瘢痕疙瘩组织与正常皮肤中S100A8及S100A9的表达；利用慢病毒RNAi技术沉默HaCaT细胞中S100A8或S100A9基因,并通过免疫组织化学染色和蛋白印迹(Western-blot)对基因敲除情况进行验证；通过HaCaT细胞与皮肤成纤维细胞共培养模型,分析表皮细胞中S100A8或S100A9对成纤维细胞活化及表皮细胞增殖、分化及迁移的影响；q-PCR技术分析HaCaT细胞基因敲除与其他相关炎症因子(IL-1β、IL-8、TNF-α、COX-2)基因表达的影响,明确各炎症因子之间的相互调节关系。结果：S100A8和S100A9在正常皮肤的表皮组织中几乎不表达,而在人增生性瘢痕和瘢痕疙瘩的表皮组织中,S100A8和S100A9的荧光信号明显增强,其主要分布在上基层的表皮细胞中,S100A8和S100A9这两种蛋白在瘢痕组织中的分布呈一定的同源性；通过慢病毒RNAi技术可有效的使HaCaT细胞中S100A8或S100A9基因沉默,Western-blot显示基因敲除后S100A8或S100A9的表达分别是野生型的21%及22%；HaCaT细胞中S100A8和S100A9基因的敲除使其增殖及迁移明显减慢,且基因敲除后HaCaT细胞形成的类器官复层细胞组织的分化较野生型减弱；与表皮细胞共培养时,皮肤成纤维细胞的活化标志α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)及前胶原蛋白-I的表达较单独培养时明显上升,但是在表皮细胞S100A8或S100A9基因沉默时,这种活化效应便被明显减弱；通过q-PCR技术分析各炎症基因之间的相互关系发现,在失水状态下表皮细胞S100A8和S100A9的表达受IL-8、TNF-α和COX-2的调节。结论：失水状态下表皮细胞中S100A8和S100A9的表达水平升高,且与其他炎症因子相互调节,并通过对表皮细胞自身的调节和对成纤维细胞的活化来参与皮肤瘢痕组织的形成。第三部分S100A8和S100A9通过TLR4和RAGE活化皮肤成纤维细胞目的：观察人重组S100A8和S100A9蛋白对人皮肤成纤维细胞活化的影响,并探讨其作用过程中的受体通路。方法：将含有S100A8和S100A9基因的pET-15b表达质粒载体转入大肠杆菌BL21中表达,表达产物进行SDS-PAGE电泳鉴定,并采用QIA expressionistTM蛋白纯化系统纯化S100A8和S100A9蛋白,通过去内毒素检测后,用来刺激人包皮组织来源的成纤维细胞(蛋白浓度分别为0.2ng/μl、1ng/μl、5ng/μl)并通过Western-blot及免疫荧光染色检测成纤维细胞中α-SMA及前胶原蛋白-I的表达,反应成纤维细胞的活化；利用特异性阻断剂分别阻断TLR-4(TAK-242)及RAGE (FPS-ZM1)后,再观察其刺激效果,从而探索S100A8和S100A9蛋白在激活皮肤成纤维化作用中的受体通路。结果：转化后的大肠杆菌在诱导后,其表达产物经过纯化,分别在SDS-PAGE电泳10及13kDa的位置有清晰的条带,说明获得蛋白是所要克隆的S100A8和S100A9；用重组人S100A8和S100A9蛋白刺激皮肤成纤维细胞,可使成纤维细胞中前胶原蛋白-I、 α-SMA的表达水平明显升高,其中S100A8的刺激效果在浓度为5ng/μl时表现最明显,而S100A9在应用1ng/μl时其刺激效果较0.2n/μl增加,但是应用5ng/μl浓度进行刺激时,其作用与lng/μl无明显差异；当用TLR4特异性的阻断剂TAK-242或RAGE的阻断剂FPS-ZM1预处理成纤维细胞后,人重组S100A8和S100A9蛋白对成纤维细胞的激活作用明显减弱,当同时应用RAGE和TLR4的阻断剂预处理成纤维细胞后,人重组S100A8和S100A9蛋白对成纤维细胞的激活作用完全被消除。结论：pET-15b.S100A8及S100A9表达质粒转入大肠杆菌后,可稳定高效的表达S100A8和S100A9蛋白；人重组S100A8和S100A9蛋白通过TLR4和RAGE来活化皮肤成纤维细胞。