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目的:先天性肛门直肠畸形是小儿外科常见的畸形之一,大部分在新生儿期才可做出诊断。肛门直肠畸形可以通过手术矫正,但对于约50%以上常合并泌尿生殖系统、心血管系统、骨骼畸形等其他系统畸形的患儿,术后预后效果往往较差。在肛门直肠正常的胚胎发育过程中,如果调控胚胎中线器官融合、细胞黏附融合及尾端外胚层的基因表达异常,往往导致肛门直肠畸形的发生。据文献报道的结果,Wnt信号通路是肛门直肠畸形研究中最为成熟且最重要的通路之一,但关于其上游的调控机制及过程尚未明确。在调控Wnt基因的表达过程中,Micro RNA（mi RNA）可通过结合Wnt基因的3’非翻译区域,抑制其表达,而环状RNA（circular RNA,circRNA）由于其强稳定性及高保守性,被认为是最具有强竞争性的miRNA“海绵”,与miRNA竞争性结合共同靶基因的3’非翻译区域,调控靶基因的表达过程。文献报告已经证实circRNA在神经胶质瘤、乳腺癌、肺癌、肝癌、胃癌等多种疾病中扮演了重要角色,但在肛门直肠畸形的研究领域却很少涉猎,而关于circRNA如何作用于miRNA进而调控Wnt信号通路表达进而影响肛门直肠畸形的发生却有着很强的研究意义。研究方法:1、选取发育成熟的Wistar大鼠（250-300g）,按雌雄比例4:1午夜合笼,次日上午阴道涂片,显微镜下见有精子记为孕第0天（E0）,标记后将孕鼠分笼喂养,在E10时,将孕鼠随机分为两组,畸形组孕鼠按125mg/kg经胃管注入1%乙烯硫脲（Ethylenethiourea,ETU）,对照组给予等计量的生理盐水灌胃,继续妊娠。在E16-21断头法处死孕鼠剖宫产取出胎鼠,胎鼠短尾或无尾且无肛门则归为畸形组,胎鼠长尾即归为对照组,收集肛门直肠畸形组与对照组胎鼠的尿直肠隔、泄殖腔膜及后肠区域组织,置于液氮后放置-80℃冰箱保存。2、选取E16、E17畸形组及对照组的组织标本进行高通量测序,根据差异表达倍数及KEGG分析,筛选出候选circRNA,应用qRT-PCR方法验证畸形组和正常组之间候选circRNA的表达。通过Sanger测序确定rno＿circ＿0005139全长序列及环化位点,利用lipo3000在IECs细胞系（大鼠肠上皮细胞系）中转染rno＿circ＿0005139的siRNA及过表达质粒,对转然后细胞进行细胞增殖、细胞凋亡及qRT-PCR实验,验证rno＿circ＿0005139的功能以及转染后mRNA水平。3、根据miRanda和psRobot软件预测剪切后的rno＿circ＿0005139的miRNA的结合位点,以及targetscan预测软件预测与Wnt5a/Wnt3a存在结合位点的miRNA。取E17-21畸形组及对照组的肛门直肠畸形组织进行qRT-PCR方法验证miR-324-3p/miR-128-3p的表达量。应用双荧光素酶实验对rno＿circ＿0005139与miR-324-3p/miR-128-3p的结合位点以及miR-324-3p/miR-128-3p与Wnt5a/Wnt3a的结合位点。利用用lipo3000及转染试剂在IECs细胞系共转染rno＿circ＿0005139的siRNA及miR-324-3p/mi R-128-3p的inhibitor,或共转染rno＿circ＿0005139的过表达质粒及miR-324-3p/mi R-128-3p的mimic,对其共转染后细胞进行细胞增殖、细胞凋亡、qRT-PCR及Western blot实验,验证共转染后Wnt5a/Wnt3a mRNA水平、蛋白质水平以及细胞增殖及凋亡的功能的变化。4、统计学分析。每组至少设置3个生物学重复样本,Western blot分析用Image-J软件检测条带相对密度,qRT-PCR数据用2-△△Ct值表示,应用SPSS21.0统计软件,对于服从正态分布的数据实验组与对照组间比较采用两样本的t检验,对于不服从正态分布的数据,实验组组间比较采用Mann-Whitney U检验进行统计学分析,所有的实验数据均以均值±标准差来表示,p<0.05认为有统计学差异。结果:1、畸形组与对照组肛门直肠组织circRNA高通量测序及验证结果:根据circRNA高通量测序得出E16的畸形组与对照组对比,上调基因16个,下调基因40个,E17上调基因38个,下调基因42个（|Fold Change|>2且P<0.05）。通过KEGG分析,我们选取以下6个circRNA作为候选circ RNA（rno＿circ＿0000436,rno＿circ＿0005139,rno＿circ＿0006880,rno＿circ＿0009285,rno＿circ＿0011909,rno＿circ＿0014367）,分别对其进行qRT-PCR验证,发现rno＿circ＿0006880在畸形组组织中表达上调,rno＿circ＿0000436,rno＿circ＿0005139,rno＿circ＿0009285,rno＿circ＿001909及rno＿circ＿0014367在畸形组组织中表达下调,结合KEGG分析及circRNA靶向位点预测结果,最终我们选取rno＿circ＿0005139作为最终候选circRNA。2、Rno＿circ＿0005139的鉴定、环化位点的确定及功能验证结果:鉴定rno＿circ＿0005139的全长为1301bp,经核质分离试验确定rno＿circ＿0005139主要存在于细胞质中,且在IECs细胞中转染rno＿circ＿0005139 siRNA后能够促进细胞凋亡,抑制其增殖。3、Rno＿circ＿0005139-miR-324-3p/miR-128-3p-Wnt5a/Wnt3a通路在肛门直肠畸形发生中的调控的详细机制及功能研究的结果:根据miRanda、psRobot及targetscan预测软件预测出rno＿circ＿0005139的靶向miRNA（miR-324-3p、miR-128-3p）以及与miR-324-3p及miR-128-3p存在结合位点的基因mRNA（Wnt5a/Wnt3a）,同时经双荧光素酶实验证实rno＿circ＿0005139与miR-324-3p/miR-128-3p之间、miR-324-3p与Wnt5a之间,以及miR-128-3p与Wnt3a之间均存在结合位点。结合qRT-PCR实验中发现的miR-324-3p以及miR-128-3p在肛门直肠畸形组织中表达上调,Wnt3a及Wnt5a在肛门直肠畸形中表达下调的结果,证实rno＿circ＿0005139可作为miR-324-3p和miR-128-3p的海绵,可以分别靶向Wnt5a和Wnt3a从而对其表达进行负调控。此外,mi R-324-3p inhibitor和miR-128-3p inhibitor逆转了rno＿circ＿0005139 siRNA对Wnt5a及Wnt3a的表达、细胞凋亡的程度以及肛门直肠发育的促进作用。结论:1、在大鼠肛门直肠组织中确实存在多种circRNA,并且畸形组与对照组组织间存在明显的表达差异。2、Rno＿circ＿0005139参与肛门直肠发育的胚胎过程,在畸形组中表达减少且干扰rno＿circ＿0005139后能够促进细胞凋亡。3、Rno＿circ＿0005139/miR-324-3p/Wnt5a及rno＿circ＿0005139/miR-128-3p/Wnt3a均参与肛门直肠畸形的发生过程,影响细胞增殖以及细胞凋亡,rno＿circ＿0005139可能是肛门直肠畸形发生中起着关键作用。