论文部分内容阅读
本文采用PCR的方法扩增了ZOT基因编码264-399氨基酸残基的C末端AG片段，插入表达质粒pBCX，构建了表达△G片段的融合蛋白表达载体pBCX-△G。将重组质粒转入表达菌BL21(DE3)中，在终浓度1 mmol/L IPTG诱导下进行表达，表达产物用SDS-PAGE检测。结果表明，融合蛋白pBCX-△G在大肠杆菌中获得表达，分子量约为45Ku。表达蛋白可溶性分析显示：pBCX-△G蛋白为可溶性表达；用50％Ni-NTA蛋白纯化树脂以非变性方法纯化融合蛋白pBCX-△G，获得了纯度较高的蛋白pBCX-△G。
另将实验室已构建好的禽流感H5N1亚型的血凝素蛋白(HA)的HA1基因重组质粒pBCX-HA1转入表达菌BL21(DE3)中，在终浓度1 mmol/L IPTG诱导下进行表达，表达产物用SDS-PAGE检测。结果表明，融合蛋白pBCX-HA1在大肠杆菌中获得表达，分子量约为72Ku。
用1d SPF鸡进行动物试验，试验分组如下：第1组10d和20d均用生理盐水免疫；第2组10d用H5N1灭活油苗免疫后,20d用生理盐水免疫；第3组10d用H5N1灭活油苗免疫后，20d用纯化的100μg HA1蛋白免疫；第4组10d用H5N1灭活油苗免疫后，20d用纯化的100μgHA1蛋白和0.1μg AG联合免疫；第5组10d用H5N1灭活油苗免疫后，20d用纯化的100μg HA1蛋白和1μg AG联合免疫。于第二次免疫后10d和20d(攻毒前)采集血清样品，用血凝抑制试验(HI)检测抗体效价；用ELISA方法分别检测血清中的IgA和IgG抗体含量；于第二次免疫后10d采集回肠样品，用免疫组化法检测回肠粘膜中的分泌型IgA(SIgA)抗体。并于第二次免疫后20d进行攻毒免疫保护试验。
试验结果如下：
(1)第5组血清中HI抗体效价平均值最高，在第二次免疫后10d和20d(攻毒前)血清检测中，分别达到了10 log2和9.9 log2：第4组次之，两次检测均为8.9 log2；而第1组HI抗体效价两次检测均为0，第2组两次检测分别为8.7 log2和8.4 log2；第3组两次检测均为8.7 log2。
(2)第5组血清中IgA抗体含量平均值显著高于其他各组，在第二次免疫后10d和20d(攻毒前)血清检测中，抗体含量分别达到了3657.61 ng/mL，和3956.81 ng/mL；第4组次之，两次检测分别为1105.48 ng/mL和1088.74 ng/mL；而第1组两次检测分别为529.78 ng/mL，和529.41 ng/mL，第2组两次检测分别为711.39 ng/mL和727.02ng/mL；第3组两次检测分别为769.44 ng/mL和713.62 ng/mL。
(3)第5组血清中IgG抗体含量平均值显著高于其他各组，在第二次免疫后10d和20d(攻毒前)血清检测中，抗体含量分别达到了7225.98 nG/mL，和6973.16 ng/mL；第4组次之，两次检测分别为6791.26 ng/mL和6842.74 ng/mL; 而第1组两次检测分别为5038.64 ng/mL和5710.17 ng/mL，第2组两次检测分别为6353.10 ng/mL和6528.14 ng/mL；第3组两次检测分别为6446.91 ng/mL和6430.90 ng/mL。
(4)第5组回肠粘膜中的分泌型IgA抗体含量(以灰度值来表示)，显著高于其他各组，平均值为180.189；第4组次之，平均值为157.483：而第1组检测平均值为110.73，第2组检测平均值为116.339；第3组检测平均值为120.803。
(5)第5组攻毒保护效果最好，以30只鸡攻毒，发病和死亡鸡数均为1只；第4组次之，发病和死亡鸡数分别为5只和2只；而第1组发病和死亡鸡数分别为0只和30只，第2组发病和死亡鸡数分别为7只和5只；第3组发病和死亡鸡数分别为6只和3只。
以上结果显示：pBCX-△G融合蛋白起到了明显的免疫增强效果，并且高剂量添加组的效果更明显。
本研究通过基因重组技术，将封闭带毒素C末端15Ku片段在大肠杆菌中表达，并获得纯化蛋白。以纯化的AG蛋白作为粘膜免疫佐剂与禽流感H5N1亚型的血凝素HA的HA1蛋白联合免疫，实验结果证实封闭带毒素C末端15Ku片段可以通过滴鼻免疫方式发挥粘膜免疫佐剂效应，增强禽流感基因工程苗的免疫原性，起到很好的免疫保护效果，从而为ZOT的应用奠定了基础。