【摘 要】
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α-乙酰乳酸脱羧酶可以去除啤酒中的双乙酰,在啤酒工业中有着广泛的应用前景.双亲灭活原生质体融合技术优点较多,是原生质体融合育种中针对无遗传标记同种不同株双亲的一种常
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α-乙酰乳酸脱羧酶可以去除啤酒中的双乙酰,在啤酒工业中有着广泛的应用前景.双亲灭活原生质体融合技术优点较多,是原生质体融合育种中针对无遗传标记同种不同株双亲的一种常用的有效方式.因此,对该实验室保存的两株产α-乙酰乳酸脱羧酶的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)进行双亲灭活原生质体融合,筛选高酶活菌株.试验首先确定了比较适合的双亲菌株培养条件.选择使用了完全培养液和发酵培养液两种培养基以及完全液体培养基20mL和40mL装液量.绘制了不同条件下的生长曲线,确定了最佳培养条件是:将菌株由斜面接种到完全固体培养基上,活化培养一天,再将其接种到液体完全培养基,37℃,200rpm,摇床培养14h,最后按5%的接种量接种到20mL的液体完全培养基,继续活化3.5-4h.将培养好的菌体收集起来,进行溶菌酶处理,制备原生质体.该试验选择了多个溶菌酶浓度,在32℃条件下处理双亲菌株.通过绘制形成率和再生率曲线,认为在32℃,用50μg/mL的溶菌酶处理双亲菌株20min,形成率较高,而且又有一定的再生能力,适合融合.将制备的V-20原生质体进行紫外灭活,3226-5原生质体进行热灭活,通过分析灭活后原生质体的融合率确定最佳融合条件是用pH9.0的40%的PEG6000,38℃,作用于混合菌液15min.该试验共得到了900株融合子,将这些融合子传代10次并测酶活.最后筛得3株菌,其酶解后的上清液酶活高于亲株.试验最后通过对融合子与双亲菌株的DNA含量的简单比较,进一步验证了筛得的菌株为融合子.
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