ΔNp63基因对宫颈癌HeLa细胞侵袭作用的研究

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目的:研究ΔNp63基因在HeLa细胞中的表达;研究抑制ΔNp63基因表达后宫颈癌HeLa细胞侵袭、转移能力的改变;探讨ΔNp63基因在HeLa细胞侵袭、转移作用中与Z0-1的关系。  方法:  1)扩增并提取ΔNp63-shRNA质粒做序列鉴定,通过脂质体法介导ΔNp63-shRNA质粒转染宫颈癌HeLa细胞,采用G418筛选出稳定表达ΔNp63-shRNA质粒的HeLa细胞,采用Western blot检测干扰质粒转染前后HeLa细胞中ΔNp63蛋白的表达;  2)采用同质粘附实验、异质粘附实验、Transwell侵袭实验及细胞划痕实验检测HeLa细胞侵袭、迁移能力的改变;  3)利用激光共聚焦扫描显微镜及Western blot实验技术检测HeLa细胞中ΔNp63干扰前后ΔNp63蛋白与ZO-1蛋白表达的改变;采用实时荧光定量PCR仪检测在ΔNp63基因干扰前后HeLa细胞中ΔNp63 mRNA与ZO-1 mRNA量的变化;探讨ΔNp63与ZO-1在细胞侵袭、转移中的相互作用及关系。  结果:  1)成功扩增、纯化ΔNp63-shRNA质粒,通过序列检测鉴定证明ΔNp63-shRNA质粒序列与设计序列相吻合,确定ΔNp63-shRNA表达质粒在48h时的转染效率为最佳,通过G418(700μg/ml)筛选3周得到稳定表达ΔNp63-shRNA质粒的HeLa细胞,Western blot实验显示干扰质粒组的ΔNp63蛋白表达与阴性质粒组及空白组比较明显降低;  2)干扰质粒组同质粘附细胞数高于阴性质粒组和空白组;干扰质粒组吸光度A值低于空白组和阴性质粒组;干扰质粒组的细胞穿膜数低于空白组和阴性质粒组;划痕实验结果显示细胞迁移数在12h时三组间比较差异无统计学意义,而在24h时干扰质粒组与空白组和阴性质粒组比较细胞迁移数出现明显降低,差异有统计学意义;  3)激光共聚焦显微镜扫描显示ΔNp63蛋白与ZO-1蛋白在HeLa细胞中均出现表达,ΔNp63蛋白主要集中在细胞核区域而ZO-1蛋白则在胞浆中表达,ΔNp63-shRNA组的荧光表达弱于空白对照组;Western blot实验结果显示ΔNp63-shRNA组中ΔNp63蛋白和ZO-1蛋白的表达与空白对照组比较明显降低;同时,实时荧光定量 PCR显示ΔNp63-shRNA组的ΔNp63的mRNA和ZO-1的mRNA分别与空白对照组比较差异有统计学意义,且ΔNp63 mRNA的表达的抑制也降低了ZO-1 mRNA的表达。  结论:  1)成功扩增、提取了ΔNp63-shRNA质粒,成功转染ΔNp63-shRNA质粒进入HeLa细胞,并获得稳定表达ΔNp63-shRNA质粒的HeLa细胞株;  2)ΔNp63基因表达的降低具有抑制 HeLa细胞的侵袭、转移能力的作用;  3)在转染ΔNp63-shRNA质粒的HeLa细胞中ΔNp63基因mRNA的量和蛋白表达受到明显抑制;  4)ΔNp63基因mRNA量和蛋白表达的降低下调了ZO-1基因mRNA的量和蛋白的表达,在参与调控HeLa细胞的侵袭、转移中ΔNp63基因可能对ZO-1基因具有调控作用。
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