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研究背景脓毒症（sepsis）是由细菌、真菌、病毒等感染因素导致的全身性炎症反应,起病急骤、病情危重、机制复杂、预后较差是其重要特征,通常会引起全身多脏器功能障碍、衰竭,已成为危重患者的常见死亡原因之一。研究表明,25%以上的脓毒症患者合并心血管并发症,心肌损伤是脓毒症患者预后不良的重要标志。目前临床上并无针对性的措施来减轻心肌损伤,因此如何保护心功能,对改善危重患者身体状况、提高脓毒症的救治率具有重要意义。NF-κB（nuclear factor-kappa B）是当代研究的热点,在过度炎症反应发生过程中起关键性作用。研究证实,脓毒症发生时,NF-κB的活性明显升高,此时应用siRNA（Small interfering Ribonucleic Acid）抑制NF-κB的P65亚基可有效抑制炎症反应。传统的给药方式中siRNA在体内易被降解,纳米技术不仅能有效保护siRNA,也能通过化学修饰后获得主动靶向功能。β1-肾上腺素受体（β1-Adrenergic Receptors,β1-AR）在人体内主要分布于心脏,心肌损伤时,膜表面受体的数量与敏感性均显著上调,可作为纳米粒的效应靶点。亲脂性化合物3-{4-[2-羟基-（1-甲基乙胺基）丙氧基]苯基}丙酸十六醇酯（PAC）与β1-AR受体选择性阻滞剂艾司洛尔（esmolol）具有类似的化学结构,以往的研究表明PAC修饰的脂质体具有较强的心肌细胞特异靶向性。故本课题设想,利用RNA干扰技术以及复合纳米材料的靶向性,体外构建β1-AR介导的P65-NF-κB-siRNA心肌细胞靶向纳米粒,并通过尾静脉注射导入小鼠体内,观察其在小鼠体内的分布情况,建立急性内毒素心肌损伤模型,研究其对心肌细胞的保护作用,从而实现减轻脓毒症心肌损伤、保护心肌功能、提高脓毒症救治率的目的。研究方法1.艾司洛尔类似物PAC的合成通过查阅文献及总结交流,确定了以3-（4-羟基苯基）丙酸为起始原料,依次经过羟基与十六烷醇成酯、环氧丙基化、异丙胺化等步骤,最后得到终产物PAC的合成路线。2.siRNA的设计合成与筛选针对P65基因,设计合成3种不同的siRNA及阴性对照siRNA,利用lipo2000将siRNA分别转染到小鼠心肌细胞系（HL-1）细胞内,培养24h后提取RNA行PCR扩增,检测各组基因表达情况,筛选出干扰效果最好的siRNA。3.纳米粒的合成通过查阅文献和借鉴经验,确定了以siRNA+聚乙二醇（polyethylene glycol,PEG）为内核、以聚乳酸-羟基乙酸共聚物[Poly（lactic-co-glycolic acid）,PLGA]为纳米材料、以维生素E聚乙二醇琥珀酸酯（Vitamin E-Tocopheryl Polyethylene Glycol 1000Succinate,TPGS）为乳化剂的制作方法,优化试剂配比及操作步骤,制备心肌靶向纳米粒,并利用激光粒径仪、Zeta电位分析仪、扫描电子显微镜等进行各表征分析,通过紫外分光光度计检测并计算纳米粒的包封率、载药量、释放率等一系列指标。通过单因素分析优化制备工艺,以得到性质最佳的纳米粒。4.纳米粒的细胞实验体外培养大鼠心肌细胞系（HL-1）,荧光显微镜检测细胞表面β1-AR受体表达情况。将各组纳米粒加入细胞培养混悬液中,通过荧光显微镜和流式细胞学技术检测细胞对纳米粒的摄取及siRNA在细胞内的分布情况。将si NC纳米粒和si435纳米粒分别转染细胞,培养24h后提取RNA进行PCR扩增,明确基因表达情况。5.纳米粒的动物实验将不同纳米粒通过尾静脉注射到C57BL/6J小鼠体内,24h后小鼠腹腔注射LPS（10mg/Kg）制作脓毒症损伤模型,小动物成像仪检测纳米粒在体内的分布情况;心尖穿刺取血检测心肌酶谱、炎症因子等的变化,取心脏组织行凋亡基因检测和组织切片染色以明确心肌损伤情况。研究结果1.合成的艾司洛尔类似物PAC纯度高,性质稳定,无生物学毒性,可用于进一步的合成研究。2.转染si435的细胞中m RNA水平表达最低,说明si435对NF-κB的P65亚基抑制作用最强,最终选择si435作为心肌靶向纳米粒的核心。3.经过不同配比的合成分析比对,875ul 5%PEG+125ul siRNA作为内水相,80mg PLGA+15mg TPGS+5mg PAC溶于8ml丙酮作为有机相,100ml 0.03%TPGS作为外水相,按照此配比合成的纳米粒粒径均一,分散性好,电势分布集中,此时的包封率,载药量,释放曲线也比较稳定。4.小鼠心肌细胞系（HL-1）细胞膜表面有明显β1-AR受体表达;不同浓度的空白纳米粒与细胞共培养,细胞存活率未受影响,说明纳米粒对细胞无毒性;荧光显微镜和流式细胞学检测纳米粒在细胞内的分布情况,发现纳米粒分布均匀,细胞摄取率高,能稳定进入细胞内部并产生明显的P65抑制效应。5.心肌靶向纳米粒均有较强的心肌细胞靶向性,说明纳米粒能靶向识别心肌细胞;小鼠腹腔注射LPS（10mg/Kg）可导致明显的心肌损伤,而注射si435纳米粒组的心肌损伤程度明显减轻;脓毒症发生时,CK、LDH、HBDH均明显升高,纳米粒保护组的表达则显著降低;炎症因子、凋亡相关基因的表达情况也均有同样的趋势,说明si435纳米粒能有效保护心肌细胞、降低脓毒症心肌损伤。研究结论1.成功合成艾司洛尔类似物PAC,纯度高,性质稳定,无生物学毒性,可用于进一步的合成研究。2.筛选出干扰效果最好的siRNA—si435,能明显抑制NF-κB P65亚基的表达。3.成功合成了PAC-P65-NF-Κb-siRNA心肌靶向纳米粒,性质稳定,粒径均一,包封率高,载药性能好,释放曲线稳定。4.纳米粒对细胞无生物学毒性,其包裹的siRNA能释放到心肌细胞内并产生干扰效应,减轻炎症反应。5.纳米粒能显著改善心肌组织的脓毒症损伤程度,减轻炎症反应,从而保护心脏功能。