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restin是本实验室于1999年在研究全反式维甲酸诱导细胞分化时克隆得到的一种黑色素瘤相关抗原家族的新基因，该基因主要表达于终末分化细胞，稳定转染该基因的细胞出现G1期阻滞，细胞增殖也受到抑制，提示restin与细胞周期的调控有关。2001年，Chomez等通过同源序列筛选Genbank数据库，也发现了该基因，并命名为MAGE-H1，但有关该基因的具体生物学功能及作用机制的报道还很少。
研究蛋白质的细胞内定位是了解蛋白质功能的基本方式之一.核内蛋白质如转录因子在许多基本细胞生物学行为诸如增殖、分化、凋亡等的调控上发挥重要作用，所以克隆核内蛋白质的基因、分析其核定位的分子机理，具有十分重要的意义。胞浆中合成的不能自由扩散入核的蛋白质通常可以以两种方式进入细胞核.如许多转录因子及其他在细胞增殖、分化等面发挥重要作用的核内蛋白质，其核转位常由蛋白质上的核定位信号(经典型)或信号分子的特异识别、修饰位点(非经典型)所介导.目前的研究表明，Restin存在于细胞核内。于是我们利用生物学软件对Restin蛋白的功能结构域进行分析，发现其N端含有一非典型二分裂核定位信号序列(nuclearlocalizationsignal，NLS)以及若干CKⅡ磷酸化位点，且预测结果显示Restin入核可能与核转运蛋白的作用密切相关。基于上述分析，我们构建了一系列Restin相关的融合表达质粒，对其进行了定位相关结构域以及潜在分子机制的分析。
我们首先对该预测NLS进行功能的验证和鉴定，克隆到Restin缺失NLS的截断体Rt1，并与EGFP融合，结合Westernblot我们发现缺失了NLS对于Restin核定位只有一定程度的影响，一定还有其他因素影响着Restin的核定位。由于在蛋白分子核转位的过程中，某些位点的磷酸化修饰对于转运蛋白的识别也是极为重要的，具有NLS特征性结构的序列也未必能够完全决定蛋白的核定位行为[4]，我们又克隆了Restin的另一个截断体Rt2，然后观察Restin的细胞定位是否同时还受到CKⅡ结构域的影响。结果发现CKⅡ位点也一起截短的Restin再也无法定位于细胞核，说明了CKⅡ位点的重要作用，也说明了预测NLS的不完全性。ATRA诱导实验还进一步提示CKⅡ位点的功能发挥可能还与维甲酸信号通路密切相关。
为进一步探索Restin核定位的潜在分子机制，我们又将Restin功能位点缺失体构建于双杂交体系中，观察它们在体内与核转运蛋白的相互作用。结果证实了Restin与核转运蛋白importinα家族成员之importinαⅡ的体内相互作用，并揭示了Restin与importin相互作用的功能结构域，NLS和CKⅡ位点与核转运蛋白均有相互作用，目前的实验已经可以确定Restin的NLS至少从功能上是不完全的，并且CKⅡ位点对其入核是举足轻重的。
综上所述，我们的实验鉴定了新蛋白RestinN端所含有的一个不完全的NLS并初步揭示了Restin的核定位相关机制。结构域缺失分析表明NLS以及CKⅡ磷酸化位点对于Restin的核定位是必需的，而Restin蛋白特有的入核方式，与许多转录因子是相似的。本课题的研究为进一步揭示新蛋白Restin的生物学功能奠定了重要基础，给后续的工作带来了十分重要的提示和启发。