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目的：由于人FOXO3A基因外显子区与FOXO3B假基因具有98%序列同源性，故在对FOXO3A基因外显子区的SNP位点的分型，以及对该基因mRNA表达定量分析时，FOXO3B假基因的存在将对结果发生干扰。本研究对此问题进行分析，以避免今后科研工作中由于FOXO3B假基因的干扰而得到错误实验结果。 方法： 1.选取14位健康献血者，采用人外周血淋巴细胞分离液分离外周血单个核细胞（PBMC），从中提取基因组DNA（gDNA）及总RNA（total RNA）。 2.采用PCR-限制性内切酶片段长度多态性（PCR-RFLP）分型法对FOXO3A的4号外显子区SNP位点rs4946936进行分型。首先使用引物设计软件设计包含FOXO3A rs4946936位点的PCR扩增引物，除1条上游引物（rs4946936-s-F）外，均位于FOXO3A及 FOXO3B同源序列处，引物（rs4946936-s-F）结合序列位于FOXO3A rs4946936位点上游与FOXO3B基因有5个碱基差异处。选取2条上游引物（rs4946936-s-F及 rs4946936-uns-F），及1条共用下游引物 rs4946936-R，rs4946936-uns-F及rs4946936-R位于FOXO3A及FOXO3B的同源序列处。分别使用2对引物以gDNA为模板对目的片段进行PCR扩增，使用SfcI酶切扩增产物进行SNP分型，比较使用不同引物PCR扩增分型结果差异，并对PCR扩增片段进行测序验证SNP分型结果。 3.以total RNA为模板反转录合成cDNA，采用实时荧光定量PCR（Real-time PCR）对 FOXO3A基因表达进行定量。首先设计1组跨内含子引物（FOXO3A-F1/FOXO3A-R1），该上、下游引物均位于FOXO3A与FOXO3B的同源序列处。同一份total RNA样本采用不去除gDNA处理及去除gDNA处理后，分别反转录合成cDNA作为模板，采用Real-time PCR法对FOXO3A基因表达进行定量分析,分析通过去除gDNA处理清除模板中可能存在的FOXO3B假基因对定量结果的影响。本研究另外使用一组引物（FOXO3A-F2/FOXO3A-R2）用于上述基因表达定量结果的验证，该引物对从文献[1]中选取，上下游引物均位于FOXO3A的3号外显子区并与FOXO3B基因序列同源。 4.选取10份已知rs4946936型别个体的total RNA样本，去除gDNA处理后，反转录合成cDNA作为模板，采用Real-time PCR法对FOXO3A基因表达进行定量。以TT型和TC型为一组，CC型为一组，利用SPSS统计学软件比较组间的基因表达水平差异，做独立样本T检验。 结果： 1.以FOXO3A特异性扩增引物（rs4946936-s-F/rs4946936-R）PCR扩增后进行SNP分型，14份样本的RFLP法分型结果与PCR扩增产物的基因测序结果完全一致，没有受到FOXO3B假基因的干扰。使用位于FOXO3A及FOXO3B同源序列处引物（rs4946936-uns-F/rs4946936-R）PCR扩增后进行RFLP法分型，结果受到FOXO3B假基因序列的干扰，表现为FOXO3A与FOXO3B的杂合型。 2.对 FOXO3A基因表达定量时，使用引物（FOXO3A-F1/FOXO3A-R1）检测10份不同RNA样本，基因表达水平均以未去除gDNA处理模板高于去除gDNA处理模板，P<0.01。并且对于随机选取的3份未去除 gDNA处理模板，引物（FOXO3A-F2/FOXO3A-R2）检测到的基因表达水平高于引物（FOXO3A-F1/FOXO3A-R1），由于两组引物以未去除 gDNA处理 RNA为模板PCR均扩增出与目的片段大小一致产物，分析该定量结果差异源于cDNA模板中有gDNA混入，FOXO3B甚至FOXO3A的DNA片段被作为模板扩增，干扰结果。3份去除gDNA处理cDNA样本中，对每一份样本分别使用两组引物检测到的基因表达水平基本一致，且分别使用两组引物以去除gDNA处理RNA为模板PCR均未扩增出与目的片段大小一致产物，再次验证：在对FOXO3A基因表达定量时，对RNA样本进行去除gDNA处理可以避免FOXO3B假基因干扰影响结果准确性。 3.用于不同SNP型别间基因表达差异分析的10个样本中，rs4946936为TT型1个，TC型3个，CC型6个。T突变型组（TT和TC型）与CC型组相比，基因表达水平未见统计学差异，p>0.05。 结论： 1.在对位于FOXO3A外显子区的SNP位点进行分型时，需要注意假基因FOXO3B的干扰。通过引物“最大错配原则”，将 PCR特异性扩增引物设计在FOXO3A与FOXO3B基因的碱基序列差异处，有可能避免由于FOXO3B假基因的相应基因片段被扩增而干扰结果。 2.在对FOXO3A的mRNA表达定量时，由于假基因FOXO3B的存在，即使跨内含子设计引物也无法避免 gDNA混入对结果的干扰，还需要对提取的RNA样本进行去除gDNA处理，以消除gDNA中FOXO3A与FOXO3B基因对mRNA定量结果的影响。