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研究背景子宫内膜异位症(endometriosis, Ems),简称内异症,指以子宫内膜样组织异位种植在子宫腔外,引起患者痛经、不孕和月经异常,是育龄妇女的常见病、多发病,发病率达10%-15%,还有逐年上升的趋势,且临床无特效治疗方法。内异症所引起的疼痛和不孕严重影响女性的身心健康和生命质量,但其发病机理目前仍有争议。早在1921年Sampson提出经血逆流种植学说,近百年来又发展了上皮化生学说、苗勒管残迹学说、免疫学说、经脉管远处转移学说、遗传学说以及有害物质致病学说等等,均难阐释清楚。对作为这些观点的主导理论——经血逆流种植学说的基本质疑是经血逆流见于90%以上的育龄妇女,几乎是生理现象,而仅10%-15%妇女罹患内异症。近年来有学者提出“在位内膜决定论”,即内异症患者在位内膜的生物学特质,使其具备更强的黏附、侵袭和血管生成能力,这一内在差异是内异症发病的决定因素,而免疫反应及局部微环境等是附加因素,或只是继发表现,或者是影响内膜命运的条件。基于以上观点,口前认为内异症的易感性再于遗传素质的差别。早在1997年Kennedy已指出,内异症是由多位点基因和环境因素相互作用导致的一种多因素遗传性疾病,且不完全遵守孟德尔遗传方式。疾病关联研究已发现多个基因与内异症遗传易感性相关,多基因位点变异很可能协同作用影响内异症的发生发展。人类可遗传的变异中最常见的一种是单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism, SNP),可导致个体对疾病的易感性不同。基因多态性可能通过基因转录活性的改变或蛋白表达的异常,影响个体对内异症的易感性及发病风险。内异症在临床和病理上均表现为一种炎性过程,异位病灶的生长有赖于腹腔液中特殊的免疫微环境,且临床流行病学及基础研究均发现内异症与免疫调节异常密切相关。目前关于基因多态性与内异症发病关系的研究更多的聚焦于与免疫调节有关的细胞因子,如白细胞介素-6(interleukin-6, IL-6)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-alpha, TNF-α)、α2-HS糖蛋白(α2-Heremans-Schmidt glycoprotein, AHSG)、转化生长因子-β1(transforming growthfactor-β1, TGF-β1)、白细胞介素-2受体p(interleukin-2receptor β, IL-2Rβ)等。关于以上免疫相关基因多态性与内异症易感性的相关研究,查阅国内外相关文献,提示研究位点主要集中在IL-6基因-174G/C位点、TNF-α基因-308G/A位点、AHSG基因第7外显子Sac I位点和AHSG2位点、TGF-β1基因-509T/C位点以及IL-2Rβ基因-627C/T位点,由于不同人种遗传背景差异导致研究结果不尽相同。关于IL-6-634C/G(rs1800796)、TNF-α-1031T/C(rs1799964)、AHSG6826C/T(rs4917)、 TGF-β1-509T/C (rs1800469)和IL-2Rβ-627C/T (rs228953)位点的研究,国外已有研究数据报道,提示这5个基因位点可能是内异症的相关易感基因。关于中国尤其是南方汉族人群这5个基因位点的研究,尚无研究数据报道。因此本研究重点探讨这5个基因位点多态性及其联合基因多态性与内异症易感性的相关性。研究目的探讨中国南方汉族妇女免疫相关基因(IL-6-634C/G、TNF-α-1031T/C、 AHSG6826C/T、TGF-β1-509T/C和IL-2Rβ-627C/T)多态性及其联合基因多态性与内异症易感性的相关性。对象与方法1.研究对象1.1研究对象收集2008年10月～2010年4月在南方医院、珠江医院及佛山市第一人民医院妇产科行腹、盆腔手术并经病理检查确诊为内异症者434例为内异症组;选择同期在珠江医院妇产科因输卵管结扎、输卵管复通、腹腔镜下输卵管通液、卵巢单纯性囊肿、畸胎瘤等进行腹、盆腔手术且术中及术后病理均未发现内异症病灶者502例为对照组。两组受检者年龄间差异无统计学意义(t=1.016,P=0.310)。所有受检者均无内异症家族史,无肿瘤及其它遗传病家族史。研究对象间不存在亲缘关系,且均知情同意。1.2标本采集两组受检者均于手术后第3日留取外周血2mL,柠檬酸钠抗凝后置于-20℃低温冰箱中保存。2.实验方法2.1DNA提取按E.Z.N.A.E-Z96Blood DNA kit的说明书抽提血细胞基因组DNA。2.2SNP分型采用以荧光定量PCR为基础的高分辨率熔解曲线分析(HighResolution Melting, HRM)技术进行SNP分型,根据仪器本身自带的软件,分析熔解曲线,得出基因型。2.3统计及分析方法用直接计数法计算各组基因频率分布,数据均用SPSS13.0进行统计分析。遗传平衡吻合度χ2检验群体基因频率分布是否符合Hardy-Weinberg平衡定律。两组之问等位基因及基因型频率比较用χ2检验(α=0.05)。用比值比(odds ratio, OR)及95%可信区间(95%CI)表示相对危险度。通过病例对照研究评估SNPs和内异症的相关性。结果1.两组研究对象年龄分布内异症组平均年龄35.4±7.9岁(其中21人年龄数据丢失),对照组平均年龄34.9±4.5岁。两组年龄分布差异无统计学意义(t=1.016,P=0.310)。2.两组基因多态性分布中国南方汉族妇女中IL-6-634C/G、TNF-α-1031T/C、 AHSG6826C/T、TGF-β1-509T/C和IL-2Rp-627C/T位点呈多态性分布,且对照组IL-6-634C/G、TNF-α-1031T/C、AHSG6826C/T和TGF-β1-509T/C位点基因频率分布均符合Hardy-Weinberg遗传平衡(x2=0.075,P=0.784；x2=0.229,P=0.632；x2=1.875,P=0.171和x2=2.176,P=0.140)。由于5个基因位点的研究数据均来源于同一个人群,尽管内异症组和对照组IL-2Rβ-627C／T位点基因频率分布均不符合Hardy-We inberg遗传平衡(x2=43.579,P=4.071×10-11和x2=85.824,P=1.967x10-20),仍可说明纳入的样本具有人群代表性。3.单个基因多态性与内异症遗传易感性3.1两组IL-6-634C/G位点基因分布内异症组和对照组等位基因C、G分布分别为78.6%、21.4%和74.3%、25.7%,基因型CC、CG、GG分布分别为63.4%、30.3%、6.3%和55.5%、37.7%、6.8%,两组等位基因及基因型分布差异均有统计学意义(x2=4.604,P=0.032和x2=6.215,P=0.045)。其中携带等位基因C使内异症发病风险提高1.057倍(95%CI为1.005～1.112),而携带G使其降低0.835倍(95%CI为0.707-0.985)；携带基因型CG与CC相比患内异症的风险低0.704倍(95%CI为0.533-0.931)。3.2两组TNF-α-1031T／C位点基因分布内异症组和对照组等位基因T、C分布分别为79.2%、20.8%和81.8%、18.2%,基因型TT、TC、CC分布分别为63.7%、31.0%、5.3%和66.5%、30.5%、3.0%,两组等位基因及基因型分布差异均无统计学意义(x2=1.994,P=0.158和x2=3.365,P=0.186)。3.3两组AHSG6826C/T位点基因分布内异症组和对照组等位基因C、T分布分别为79.1%、20.9%和74.3%、25.7%,基因型CC、CT、TT分布分别为62.0%、34.0%、4.0%和54.1%、40.5%、5.4%,两组等位基因及基囚型分布差异均有统计学意义(x2=5.701,P=0.017和x2=6.158,P=0.046)。其中携带等位基因C使内异症发病风险提高1.063倍(95%CI为1.011-1.118),而携带T使其降低0.817倍(95%CI为0.691-0.965),携带基因型CT与CC相比患内异症的风险低0.733倍(95%CI为0.559-0.962)。3.4两组TGF-β1-509T/C位点基因分布内异症组和对照组等位基因T、C分布分别为58.4%、41.6%和56.1%、43.9%,基因型TT、TC、CC分布分别为33.8%、49.3%、16.9%和29.9%、52.5%、17.6%,两组等位基因及基因型分布差异均无统计学意义(x2=1.033,P=0.309和x2=1.670,P=0.434)。3.5两组IL-2RD-627C/T位点基因分布内异症组和对照组等位基因C、T分布分别为51.5%、48.5%和52.0%、48.0%,基因型CC、CT、TT分布分别为34.5%、34.0%、31.5%和37.4%、29.2%、33.4%,两组等位基因及基因型分布差异均无统计学意义(x2=0.046,P=0.831和x2=2.540,P=0.281)。见表10。4.联合基因型多态性与内异症遗传易感性4.1两组TNF-α-1031T/C和IL-6-634C/G联合基因型分布内异症组和对照组联合基因型TT+CC、TC+CC、CC+CC、TT+CG、TC+CG、CC+CG、TT+GG、 TC+GG、CC+GG分布分别为39.4%、19.4%、4.6%、20.6%、8.8%、0.9%、3.5%、2-3%、0.5%和36.7%、17.4%、1.4%、26.1%、10.4%、1.2%、3.8%、2.6%、0.4%,两组联合基因型分布差异无统计学意义(x2=13.153,P=0.107)。其中与联合基因型TT+CC携带者相比,其余联合基因型携带者患内异症的风险均无显著差异(P均>0.05)。4.2两组AHSG6826C/T和IL-6-634C/G联合基因型分布内异症组和对照组联合基因型CC+CC、CT+CC、TT+CC、CC+CG、CT+CG、TT+CG、CC+GG、 CT+GG、TT+GG分布分别为40.3%、20.6%、2.5%、17.8%、11.1%、1.4%、3.9%、2.3%、0.0%和29.7%、22.4%、3.4%、20.4%、15.2%、2.0%、4.0%、2.8%、0.0%,两组联合基因型分布差异无统计学意义(x2=12.987,P=0.072)。其中与联合基因型CC+CC携带者相比,CT+CG携带者患内异症的风险低0.537倍(95%CI为0.352-0.820,P’=0.028),其余联合基因型携带者患内异症的风险均无显著差异(P均>0.05)。4.3两组TGF-β1-509T/C和IL-6-634C/G联合基因型分布内异症组和对照组联合基因型TT+CC、TC+CC、CC+CC、TT+CG、TC+CG、CC+CG、TT+GG、 TC+GG、CC+GG分布分别为20.4%、33.6%、9.7%、11.6%、13.0%、5.6%、1.9%、2.8%、1.6%和17.2%、28.5%、9.8%、10.2%、20.8%、6.6%、2.4%、3.2%、1.2%,两组联合基因型分布差异无统计学意义(x2=13.118,P=0.108)。其中与联合基因型TT+CC携带者相比,TC+CG携带者患内异症的风险低0.526倍(95%CI为0.339-0.817,P’=0.032),其余联合基因型携带者患内异症的风险均无显著差异(P均>0.05)。4.4两组IL-2Rβ-627C/T和IL-6-634C/G联合基因型分布内异症组和对照组联合基因型CC+CC、CT+CC、TT+CC、CC+CG、CT+CG、TT+CG、CC+GG、 CT+GG、TT+GG分布分别为20.7%、21.7%、20.7%、10.7%、10.7%、9.1%、3.0%、1.6%、1.6%和19.9%、16.7%、18.9%、14.7%、10.5%、12.9%、2.8%、2.0%、1.6%,两组联合基因型分布差异无统计学意义(x2=9.489,P=0.303)。其中与联合基因型CC+CC携带者相比,其余所有联合基因型携带者患内异症的风险均无显著差异(P’均>0.05)。4.5两组AHSG6826C/T和TNF-α-1031T/C联合基因型分布内异症组和对照组联合基因型CC+TT、CT+TT、TT+TT、CC+TC、CT+TC、TT+TC、CC+CC、 CT+CC、TT+CC分布分别为38.2%、22.7%、2.8%、20.1%、9.7%、1.2%、3.7%、1.6%、0.0%和35.7%、26.9%、4.0%、16.6%、12.8%、1.0%、1.8%、0.8%、0.2%,两组联合基因型分布差异无统计学意义(x2=12.762,P=0.120)。其中与联合基因型CC+TT携带者相比,其余所有联合基因型携带者患内异症的风险均无显著差异(P’均>0.05)。4.6两组TGF-D1-509T/C和TNF-α-1031T/C联合基因型分布内异症组和对照组联合基因型TT+TT、TC+TT、CC+TT、TT+TC、TC+TC、CC+TC、TT+CC、 TC+CC、CC+CC分布分别为23.8%、31.0%、8.8%、8.1%、15.0%、7.9%、1.9%、3.2%、0.2%和19.6%、34.5%、12.4%、10.0%、15.8%、4.6%、0.2%、2.2%、0.6%,两组联合基因型分布差异有统计学意义(x2=18.814,P=0.012)。其中与联合基因型TT+TT携带者相比,其余联合基因型携带者患内异症的风险均无显著差异(P’均>0.05)。4.7两组IL-2Rβ-627CAT和TNF-α-1031T/C联合基因型分布内异症组和对照组联合基因型CC+TT、CT+TT、TT+TT、CC+TC、CT+TC、TT+TC、CC+CC、 CT+CC、TT+CC分布分别为21.0%、22.4%、20.3%、12.8%、8.4%、9.8%、0.7%、3.3%、1.4%和24.0%、19.0%、23.8%、11.3%、9.9%、9.1%、2.2%、0.2%、0.6%,两组联合基因型分布差异有统计学意义(x2=22.939,P=0.001)。其中与联合基因型CC+TT携带者相比,CT+CC携带者患内异症的风险高18.511倍(95%CI为2.390-143.383,P’=0.000),其余联合基因型携带者患内异症的风险均无显著差异(P’均>0.05)。4.8两组TGF-β1-509T/C和AHSG6826C/T联合基因型分布内异症组和对照组联合基因型TT+CC、TC+CC、CC+CC、TT+CT、TC+CT、CC+CT、TT+TT、 TC+TT、CC+TT分布分别为19.4%、31.5%、1.1%、13.9%、16.0%、4.2%、0.5%、1.9%、1.6%和15.8%、30.9%、7.4%、13.4%、18.2%、8.8%、0.6%、3.4%、1.4%,两组联合基因型分布差异有统计学意义(x2=15.708,P=0.042)。其中与联合基因型TT+CC携带者相比,CC+CT携带者患内异症的风险低0.385倍(95%CI为0.205-0.721,P’=0.016),其余联合基因型携带者患内异症的风险均无显著差异(P’均>0.05)。4.9两组TGF-β1-509T/C和IL-2Rβ-627C/T联合基因型分布内异症组和对照组联合基因型TT+CC、TC+CC、CC+CC、TT+CT、TC+CT、CC+CT、TT+TT、 TC+TT、CC+TT分布分别为12.8%、16.3%、5.4%、10.5%、17.5%、6.1%、10.5%、15.4%、5.6%和12.1%、18.1%、7.2%、9.5%、15.1%、4.6%、8.5%、19.1%、5.8%,两组联合基因型分布差异无统计学意义(x2=6.650,P=0.575)。其中与联合基因型TT+CC携带者相比,其余所有联合基因型携带者患内异症的风险均无显著差异(P’均>0.05)。4.10两组IL-2Rβ-627C/T和AHSG6826C/T联合基因型分布内异症组和对照组联合基因型CC+CC、CT+CC、TT+CC、CC+CT、CT+CT、TT+CT、CC+TT、 CT+TT、TT+TT分布分别为19.6%、22.1%、20.5%、13.3%、10.5%、10.0%、1.6%、1.4%、0.9%和18.8%、14.7%、20.4%、16.5%、12.7%、11.5%、2.2%、1.6%、1.6%,两组联合基因型分布差异无统计学意义(x2=11.404,P=0.180)。其中与联合基因型CC+CC携带者相比,其余所有联合基因型携带者患内异症的风险均无显著差异(P’均>0.05)。结论1.中国南方汉族妇女中,IL-6-634C/G和AHSG6826C/T位点多态性与内异症发生相关,然而,TNF-α-1031T/C、TGF-β1-509T/C和IL-2Rβ-627C/T位点多态性与内异症发生无明显关联。2.中国南方汉族妇女中,TGF-β1-509T/C和TNF-α-1031T/C、IL-2Rβ-627C/T不口TNF-α-1031T/C、TGF-β1-509T/C和AHSG6826C/T、AHSG6826C/T不口IL-6-634C/G、TGF-β1-509T/C和IL-6-634C/G联合基因型多态性与内异症发生相关,然而,TNF-α-1031T/C和IL-6-634C/G、IL-2Rβ-627C/T和IL-6-634C/G、AHSG6826C/T和TNF-α-1031T/C、TGF-p1-509T/C和IL-2Rp-627C/T、IL-2Rβ-627C/T和AHSG6826C/T联合基因型多态性与内异症发生无明显关联。3.内异症是一种多基因多态性联合致病的遗传性疾病,联合基因型可使内异症的发病风险增加。