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病毒靶向肿瘤治疗是近年来出现的肿瘤生物治疗中较有希望的治疗方法之一。腺病毒由于具有：低致病性，不整合到宿主细胞基因组，可感染细胞谱广，病毒基因结构稳定，可以方便生产高滴度的病毒而且相对稳定等优点，是目前在病毒肿瘤治疗中研究最多的病毒。另外人群中野生型腺病毒的感染率相当高，而腺病毒也有较长的研究历史，因此以腺病毒作为治疗肿瘤的工具也具有较高的安全性保证。 研究发现腺病毒感染宿主细胞须要通过其E1B区早期转录蛋白作用于宿主细胞的P53蛋白，并使其失活，从而避免P53蛋白对其转录抑制作用，使病毒得以在宿主细胞中进一步复制。以往的研究表明，大部分人类肿瘤中均存在p53基因突变，因此E1B55kD蛋白缺失的重组病毒只能在P53功能异常的肿瘤细胞中复制，而在正常细胞中该重组病毒由于缺乏对抗P53蛋白的病毒产物，不能有效复制，因此具有肿瘤靶向治疗的特点。另外E3基因编码的数种蛋白使腺病毒具有免疫逃避能力如：gp19KD蛋白可抑制细胞表面MHC-Ⅰ型抗原表达；10.4／14.5KD和14.7KD蛋白可抑制FasL或TNFα介导的淋巴细胞毒作用，因此可以通过删除E3区增强被感染宿主细胞被免疫识别能力，来增强治疗效果。 但是经改造后的腺病毒其治疗的安全性、有效性和临床适用性需要在进一步的人体试验中进行观察。细胞实验和动物试验初步验证了E1B缺失重组腺病毒治疗具有一定的肿瘤特异性，并且显示了一定的抑瘤率。动物毒理学研究显示，E1B缺失重组腺病毒对试验动物的急性、长期毒性实验无明显毒性反应和过敏反应。因此E1B缺失重组腺病毒被国家药品食品管理局批准进行人体试验研究。我们通过对肿瘤患者的试验性治疗观察E1B缺失重组腺病毒人体应用的短期安全性并对环境的安全性进行评价，在获得基本肯定后进一步对其治疗的有效性进行观察。 通过此次E1B缺失重组腺病毒人体治疗的观察，结合国外病毒治疗的经验，我们发现，通过重组腺病毒治疗肿瘤具有很高的安全性，也出现了一定的疗效，浙江人学博「研究生学位论文并发现疗效的出现与免疫因素可能有关，但同时治疗作用仍不够理想，因此有必要对其作进一步的改进。 目前增强病毒治疗效果的策略主要有:1.通过对病毒自身结构的改进，如鞭毛修饰等，以增强其靶向性和治疗效果;2.使病毒携带特定的治疗基因，增强其效果;3.研究病毒增强化疗、放疗效果的机制，降低化疗和放疗的剂量，减少它们的副作用;4.继续寻找安全且更具溶瘤效果的病毒用以治疗。 我们认为结合基因治疗将有助于发挥病毒治疗的优势，首先可复制病毒携带治疗基因可以大大增强所携带基因的表达，其次通过肿瘤特异性启动子启动所携带治疗基因可以增强肿瘤基因治疗的靶向性。 M记kine是属于肝素结合因子的一种多肚，对细胞的生长和分化起重要作用，出生以后仅存在于肾脏。研究发现Midkine在肝细胞癌、胃癌、胰腺癌、结肠癌、食道癌、膀肤癌、卵巢癌、前列腺癌、乳腺癌、肺癌、脑肿瘤等多种肿瘤组织中均有表达，与肿瘤的发生和生长密切相关。而且Midkine的表达与肿瘤发展的进程及恶性程度密切相关，在癌前病变、低度恶性和高度恶性肿瘤组织中表达量依次增高。肿瘤坏死因子a(TNFa)是一种单核因子，主要由单核细胞和巨噬细胞产生，具有确定的杀伤或抑制肿瘤细胞的生物学效应，但是体内研究发现其抑制肿瘤的起效剂量要高于毒性剂量，因此利用TNFa蛋白治疗肿瘤存在很大的危险性。但是通过采用MK启动子启动TNFa的表达，可以使治疗具有肿瘤靶向性。 为此我们通过在细菌内同源重组的方法构建了携带以Midkine启动子(MK)启动人rrNFa基因的重组腺病毒载体:Ad一MK一TNFa，研究代号ZUCIO08，试图以此为研究对象验证该设计原理。 通过在HEK293病毒包装细胞中扩增最终获得了目的重组腺病毒载体rAd一MK一TNFa，同时我们通过相同的方法构建了对照空载体病毒、和CMV启动子启动TNFa的阳性对照病毒，代号分别为ZUCI006、ZUCIO07。通过对三者对肿瘤细胞系和正常细胞系的不同作用，来比较它们的差别。 实验表明，不同肿瘤对ZUCI008的反应存在着很大的不同，有较敏感的细胞系如HL60，也有极不敏感的细胞系如K562。我们发现ZUCI007和ZUCIO08在100MOI以匕时对多种肿瘤细胞系均有确切的抑制生长作用，而且呈现一定的量效关系，其中ZUCI007对成纤维细胞具有明显的抑制作用，P<0.05，而ZUCIO08浙江人学博卜旬.究生学位论文对正常细胞系没有明显的抑制作用，提示ZUCI008具有一定的肿瘤选择性，可能是通过MK启动子启动TNFa来实现，而ZUCI007由于采用的是CMV启动子，因此不具有选择性。在I000MOI时空载体ZUCIOO6对Smml7721、RKO细胞没有抑制作用，P>0.5，而ZIJCIOO7和ZUCIO08对Smml7721、RKO细胞贝IJ有显著的抑制作用，P<0.肠，但是两者的抑制作用没有显著性差异，P>0.05，说明TNFa是Z[JCIOOS发挥其抑制肿瘤生长作用的重要因素。比较ZUCIOO7和ZU C1008对肿瘤细胞的作用发现，ZucI007对HePGZ的抑制作用要显著强于ZUCI008，而对HL60的抑制作用也强于ZUCI0