论文部分内容阅读
k粉，2—邻—氯苯-2-甲氨基环己酮，最早被用作人和动物的麻醉剂。然而近年来，k粉在西方和亚洲一些国家滥用成了娱乐性药物。面对这种滥用的趋势，快速灵敏的k粉检测技术非常必要。目前有多种方法用于k粉的检测，包括气相色谱—质谱联用技术、液相色谱—质谱联用技术、液相层析—串连质谱技术、毛细管电泳—质谱法(MS)联用技术、ELISA等等。色谱类方法有很好的灵敏性和特异性，但由于需要昂贵的设备和试剂、繁琐的实验步骤且很难提供多维的原位信息等缺点，使其在实际应用中受到限制。ELISA法虽然灵敏性比色谱法好，但特异性更差些。且上述检测方法中大多数很耗时。因此建立一个简单、敏感、特异性好、高通量的检测方法很有必要。
ATP合酶(F0F1—ATPase)是生物体内负责能量转化的酶，现已证明是一个旋转分子马达，包括“定子(ab2δα3β3)”和“转子(γεCn)”两部分。以往对于F0F1—ATPase旋转的单分子研究主要集中于ATP水解驱动的亚基旋转的基础研究上，将这种旋转分子马达应用到实际的检测中一直都处于尝试阶段。本文建立了质子梯度驱动F0F1—ATPase亚基旋转的研究体系，应用免疫学和生物化学方法，构建了基于ATP合酶的免疫旋转生物传感器(Immuno—rotary biosensor，IRB)，并利用荧光探针的荧光强度量化F0F1—ATPase活性，应用到高灵敏度检测K粉中。具体研究内容如下：
1.从光合细菌Rhodospirillum rubrum中提取得到了其光合色素体chromatophores(每个chromatophore上平均含有一个FoF1—ATP合酶和11个光合反应中心)，经电镜观察chromatophores的平均直径为76±16 nm。且具有较高的活性(水解活性为60μmol/mg． min)，其重组体系旋转更灵敏，可以作为研究ATP合酶水解和合成活性的实验材料。
2.利用对pH变化敏感的荧光探针F1300标记到chromatophores膜内侧，通过荧光强度变化表征ATP合成引起的质子转运过程。研究发现，在chromatophores的β亚基上连接不同负载时，可以不同程度影响其ATP合成活性。在此基础上构建的IRB可以通过“β亚基抗体—生物素—亲和素—生物素—Ketamine抗体(TFlβ antibody——biotin——streptavidin——biotin——Ketamine antibocly)”复合物捕获溶液中不同浓度的Ketamine，表现出不同的荧光增长速率。IRB的捕获机制同常规ELISA一致(基于抗体—抗原的相互作用)，但其检测机制却又明显不同于ELISA，即它利用了ATP合酶在ATP合成过程中的质子转运特性通过检测荧光探针信号变化来反映，因此极大提高了检测灵敏度，其感应灵敏度可达10-13g/L。较现有其它方法的检测灵敏度提高4个数量级，有进一步深入研究的必要性，同时也为该方法的开发应用积累了重要信息。