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目的:观察高血压大鼠正中隆起室管膜细胞在不同时期的形态学变化。
方法:选择健康雄性Wtstar大鼠60只,体重200g-250g,随机分为五组:①对照组(n=12):不做任何处理;②用药1周组(n=12);③用药2周组(n=12);④用药3周组(n=12);⑤用药4周组(n=12)。
1高血压模型制备:实验动物予以一氧化氮合酶抑制剂-左旋硝基精氨酸(L-NNA)15 mg/d·kg,分别于8:00 AM、8:00 PM两次腹腔注射,制备高血压动物模型。
2光镜标本制备:常规经心灌注、固定、取脑,常规石蜡包埋,连续石蜡切片,片厚5um。常规HE染色、nestin免疫组化染色、封片。显微镜观察、照相。
3电镜标本制备:麻醉、灌注同光镜标本制备,但灌注液为含2％多聚甲醛和2.5％戊二醛的混合磷酸缓冲液。取包含ME的脑块用PBS冲洗,梯度酒精脱水,叔丁醇置换,真空干燥、喷金,日立S-3500N观察、照相。透射电镜样品制备与扫描电镜样品制备相同,取下ME,放入4％戊二醛固定,1％饿酸后固定,树脂包埋,切片,T-S7500透射电镜观察、照相。
4统计学处理:Nestin阳性细胞采用麦克奥迪数码医学图像分析系统(Motic Med6.0)测定灰度值。数据用均数加减标准差((-x)±s)表示。应用SNK-q检验,进行两两比较,以P＜0.05为有显著性差异。
结果:1大鼠在连续注射左旋硝基精氨酸(L-NNA)4周后动脉收缩压(SBP)由对照的99.83±7.01mmHg增加到187.29±5.84mmHg,与对照组大鼠相比明显升高(P＜0.05),随后SBP维持较稳定的高水平,提示高血压动物模型制备成功。造模稳定成功率高。
2光镜观察结果:
2.1正常对照组:光镜下ME内有丰富的毛细血管,血管周围组织排列紧密。室管膜细胞为单层排列,胞体扁平,胞核大小不一,呈圆形或椭圆形,脑室面光滑。
2.2模型组:在用药1周组,室管膜细胞胞体增大,室管膜下血管扩张,可见室管膜上细胞。在用药2周组,室管膜细胞排列整齐,室管膜下细胞排列密集,胞核深染,软膜下血管丰富。在用药3周组,室管膜下层变薄,软膜下血管增多,管腔变大。在用药4周组,室管膜细胞扁平,排列稀疏,软膜下血管扩张明显,呈层样排列。
3 nestin免疫组织化学染色结果观察
3.1对照组:nestin免疫阳性细胞呈棕黄色,多分布于室管膜下层,胞体多呈梭型或杆状,灰度值测定为135.48±7.31。
3.2模型组:用药1周组:室管膜下阳性细胞排列密集,胞体多呈圆形或椭圆形,室管膜细胞层阳性细胞胞体变大,排列稀疏不等。灰度值测定为142.72±8.35。用药2周组:室管膜下阳性细胞排列稀疏,胞体多呈梭形,室管膜细胞层阳性细胞少见。软膜下阳性细胞排列密集。灰度值测定为153.54±6.02。用药3周组:室管膜下阳性细胞排列均匀,胞体多呈椭圆形或梭形,室管膜层阳性细胞少见。灰度值测定为146.78±5.84。用药4周组:室管膜下层阳性细胞排列稀疏;室管膜层阳性细胞增多,多呈圆形。灰度值测定为166.64±8.72。
4扫描电镜观察结果:
4.1正常对照组:ME是连于视交叉与乳头体之间的薄带,中央为无纤毛区,两侧为纤毛区,两者之间有明显界限。无纤毛区分泌颗粒稀少,交界区可见大小不等的分泌颗粒。
4.2模型组:在用药1周组,无纤毛区可见分布均匀而密集的球形分泌颗粒;交界区室管膜细胞的纤毛间可见大小不等的球形分泌颗粒。在用药2周组,无纤毛区分泌颗粒少见,可见密集分布的微绒毛;交界区可见散在的球形分泌颗粒,直径与1周组比较略偏大。在用药3周组,无纤毛区可见丰富的吞噬细胞样室管膜上细胞,其胞体多呈圆形或梭形,表面光滑,室管膜表面可见密集的分泌颗粒,其大小不均,表面光滑,在分泌颗粒之间可见稀疏的微绒毛。在用药4周组,无纤毛区分泌颗粒增多,微绒毛少见;交界区室管膜细胞表面可见密集的分泌颗粒,直径偏小。
5透射电镜观察结果:
5.1正常对照组:室管膜细胞呈梭形,胞核椭圆形,细胞之间有紧密连接,室管膜下层有较多的有髓纤维。在室管膜细胞的脑室面可见处于不同状态的分泌颗粒,内容物为大小不等的空心囊泡和实心颗粒。
5.2模型组:至用药4周时,室管膜细胞脑室面可见较多不规则分泌颗粒,内容物多为致密实心颗粒。有的分泌颗粒内无致密实心颗粒但呈均质状,偶尔可见有空心囊泡的分泌颗粒。
结论:①用L-NNA腹腔注射成功制备了高血压大鼠动物模型。②在光镜下观察到高血压初期(1周组)ME室管膜细胞胞体增大,室管膜下血管扩张,室管膜下细胞排列密集。高血压后期(3、4周组)室管膜细胞排列稀疏,室管膜下细胞深染,软膜下血管扩张明显。③Nestin免疫阳性细胞在高血压初期(1周组)多出现在ME室管膜下层,在高血压后期(4周组)多出现在室管膜层。④在电镜下,ME脑室面在高血压初期(1周组)可见分布均匀而密集的分泌颗粒,在高血压后期(3、4周组)分泌颗粒多分布于ME交界区,呈多层样排列;在高血压组室管膜的分泌颗粒多为有致密实心颗粒或呈均质状的分泌颗粒,有空心囊泡的分泌颗粒少见。