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视网膜母细胞瘤(retinoblastoma,Rb)是小儿最常见的眼内恶性肿瘤,化疗已成为Rb保守治疗及手术前后辅助治疗的重要手段,如何减少耐药性的产生、提高肿瘤细胞对化疗药物的敏感性,始终是研究的热点之一。近年研究显示,抑制肿瘤细胞的抗凋亡活性可提高肿瘤细胞对化疗药物的敏感性,而其中Akt信号通路是多种肿瘤的重要抗凋亡通路,其对肿瘤细胞化疗敏感性的影响日益受到关注,其作用机制仍有待进一步研究。
目的：
探讨Akt信号通路活性对视网膜母细胞瘤SO-Rb50细胞化疗敏感性的影响,及其产生作用的可能机制。
方法：
采用梯度浓度诱导法建立耐长春新碱(vincristine,VCR)的SO—Rb50细胞株(SO—Rb50/VCR)；CCK-8(cell counting kit-8)法检测VCR、LY294002单独或联合作用对细胞的杀伤力；Western Blot法检测Akt、p—Akt(phospho—Akt)、cleaved caspase-3、MDR1(p—gp)、cyclin D1蛋白在药物作用前后表达量的改变；流式细胞仪法检测药物作用前后细胞周期的改变；罗丹明123潴留实验评价多药耐药蛋白p—gp的转运功能。
结果：
1.采用梯度浓度诱导法经过约9个月成功建立起SO-Rb50/VCR细胞株,VCR作用于SO-Rb50和SO-Rb50/VCR细胞48h的半数抑制浓度IC50值分别为6.24±2.06 nM和83.21±4.64 nM；SO-Rb50/VCR细胞多药耐药蛋白p—gp的表达较SO-Rb50细胞明显增高。
2.LY294002作用于SO-Rb50和SO-Rb50/VCR细胞48h的IC50值分别为11.16±0.57μ M和10.32±0.25μM；用不同浓度的LY294002抑制细胞Akt信号通路的活性后,VCR作用于SO-Rb50细胞48h的IC50值从6.24±2.06 nM降至0.69±0.09 nM(5μ MLY294002)和0.15±0.05 nM(10μMLY294002)；VCR作用于SO-Rb50/VCR细胞48h的IC50值从83.21±4.64nM降至5.71±1.02nM(5μM LY294002)和2.25±0.59nM(10μM LY294002)。
3.用VCR(10nM)、LY294002(5μM和10μM)单独或联合作用于两株细胞48h,细胞Akt活性随LY294002浓度的增加而降低；VCR单独作用即可引起Akt活性明显下降；两种药物联合作用并没有进一步降低Akt活性；但两种药物的联合作用可明显增加凋亡蛋白cleaved caspase-3的生成；细胞周期调控蛋白cyclin D1在药物作用后无明显下降；而药物作用前后Akt的总量始终保持稳定。
4.用VCR(10nM)、LY294002(5μM和10μM)单独或联合作用于两株细胞48h,LY294002对G0/G1期和S期细胞的百分比无明显影响,VCR可阻断细胞从G0/G1期向S期过渡；两种药物联合作用并没有进一步改变VCR对细胞周期的影响。
5.用5μM和10μM的LY294002作用于SO-Rb50/VCR细胞48h,p—gp随Akt活性的下降而有轻度减少；细胞对罗丹明123的潴留明显增加并呈LY294002浓度依赖性。
结论：
Akt活性的改变参与了VCR介导的细胞杀伤作用；抑制Akt活性可降低耐药和非耐药的SO-Rb50细胞的生存力,并提高细胞对化疗药物VCR的敏感性；此种作用产生的机制包括增加细胞的凋亡和增加化疗药物在细胞内的积聚,而非通过改变细胞周期的进程。因此,抑制Akt信号通路的活性可能是降低Rb耐药性、提高Rb化疗疗效的一个靶点。