论文部分内容阅读
目的:前列腺素E2（prostaglandin E2,PGE2）是具有高生物活性的脂类化合物,是一种复杂的多功能的骨代谢调节因子。其参与血管形成、骨修复和软骨代谢。PGE2现已被公认为组织工程骨和软骨组织再生解决方案中重要的靶分子。作为口腔领域牙周改建的信号分子,PGE2加快正畸牙齿移动已在大量的研究中得到证实。在骨组织里PGE2主要由成骨细胞合成,可直接与成骨细胞和破骨细胞作用,亦可与骨髓细胞间接作用,通过增加破骨细胞和成骨前体细胞的募集介导骨改建。PGE2对骨改建的作用是双相的,在低浓度或是有糖皮质激素存在的情况下,PGE2可促进成骨细胞的分化从而促进骨形成;而在高浓度或是有胰岛素样生长因子-1存在的情况下,PGE2可抑制胶原的合成从而抑制骨形成。在正畸治疗过程中PGE2起关键的调控作用,通过调节骨形成和吸收直接或间接改建牙槽骨。但由于PGE2是一种局部激素,局部合成,局部灭活,半衰期极短（一般是1-2分钟）,限制了它的应用。因此,在正畸领域的研究中,构建PGE2控释系统缓释PGE2就显得尤为重要。乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）是聚乳酸与羟基乙酸按照不同配比制备成的生物降解型高分子聚合缓释材料,是少数取得美国FDA批准的载体材料之一,已用于临床。其毒性低、安全性高、稳定性好,生物相容性良好,常作为多肽、蛋白质及抗肿瘤类药物的载体。其通过其自身降解,可在几周或几个月内以较稳定的速率释放药物,维持有效血药浓度,减少药物半衰期的给药次数,适用于半衰期短而又需要长期使用的药物。现已广泛用于组织工程支架和药物载体。有研究发现纳米羟基磷灰石（nano-hydroxyapatite particle,nano-HAP）有促进成骨细胞增殖、粘附和矿化相关蛋白表达的作用。骨基质中矿物盐约占35%,主要为钙和磷酸组成的羟基磷灰石（Hydroxyaptite,HA）。骨基质的形成是成骨细胞分化和矿化的结果,对于骨的形成至关重要。当成骨细胞进入分化阶段,分泌大量细胞外基质,包I括型胶原,非胶原蛋白和蛋白聚糖,在成骨细胞及各种离子、蛋白、脂类、酶调节下,钙离子和磷酸根离子达到一定浓度后在基质小泡中矿化形成羟基磷灰石,进而沉积于I型胶原纤维上继续矿化生成更多的羟基磷灰石。人工合成的羟基磷灰石无论在组成还是结构上都与人体硬组织极为相似,因其良好的生物相容性、骨诱导性已被广泛用做生物医用材料和药物载体。HA降解释放的Ca2+、PO43-离子,可以促进骨基质矿化加速新骨形成。有研究证实,HA和PLGA复合后可明显提高基础材料的强度,减慢降解速度,其碱性产物可中和部分聚乳酸产生的酸性产物,表面粗糙度和孔隙率的增加能促进成骨细胞的附着及药物的吸附。研究开发优良载体系统以克服药物及不同载体材料的弱点对医用领域至关重要。本研究构建负载PGE2的PLGA微球（PGE2-PLGA-MSs）药物载体拟解决PGE2半衰期短的问题,通过药物包封率、缓释曲线的实验研究以确定载体的理化性质和缓释性能;通药物及载体对MC3T3-E1细胞生物学性能及成骨基因表达的影响拟明确低浓度PGE2促进成骨的浓度区间及载体的缓释效应,以及对成骨细胞增殖分化的影响规律;通过对成骨细胞同时施加PGE2与羟基磷灰石二种成骨诱导因素观察二者对成骨细胞生长分化作用是否正向促进;通过HAP-PLGA-PGE2杂化系统构建寻找优良的药物载体系统及探索其制备方法和条件。我们期望通过上述系列研究,能为缓释药物载体的开发利用提供研究方向和量化指标。研究方法:采用膜乳化法制备粒径均匀的PGE2-PLGA-MSs,酶联免疫分析法测定微球的载药量和体外药物释放。以无添加物培养基、空白微球、羟基磷灰石（HAP）作为对照组,PGE2、PGE2+HAP和PGE2-PLGA-MSs（0.0125、0.05、0.2、0.8、3.2、12.8μmol/L）为实验组,与成骨样细胞株MC3T3-E1孵育,分别于不同时间用MTT法检测成骨样细胞株MC3T3-E1增殖活性、碱性磷酸酶试剂盒检测样本的A值、显微镜计数每个视野下的矿化结节数量、流式细胞仪检测细胞增殖周期和凋亡,RT-PCR检测成骨相关基因及转录因子表达水平。结果:1、PLGA负载PGE2,实验制备的PGE2-PLGA-MSs粒径约5μm,且粒径分布窄;PLGA（IV=0.28）为载体材料的微球载药量为2.5%,48 h药物累积释放量约80%。2、PGE2、PGE2+HAP、缓释PGE2对MC3T3-E1细胞增殖具有双向调节作用,0.0125μmol/L浓度促进细胞增殖,0.2、0.8、3.2、12.8μmol/L浓度抑制细胞增殖且具有剂量依赖性,缓释PGE2和PGE2+HAP在24h时抑制作用低于等浓度的PGE2,而在48h、72h三组无显著差异;0.05μmol/L浓度对细胞增殖无影响。3、PGE2、PGE2+HAP、PGE2-PLGA-MSs对MC3T3-E1细胞周期具有双向调节作用,0.0125μmol/L浓度促进细胞增殖;0.2、0.8、3.2、12.8μmol/L浓度抑制细胞增殖,PGE2-PLGA-MSs抑制作用明显低于等浓度的PGE2、HAP+PGE2,PI指数高于等浓度的PGE2、HAP+PGE2并具有剂量依赖性;0.05μmol/L浓度对细胞周期无影响。4、PGE2、PGE2+HAP、PGE2-PLGA-MSs对MC3T3-E1细胞凋亡具有双向调节作用,0.0125μmol/L浓度抑制细胞凋亡;0.2、0.8、3.2、12.8μmol/L浓度促进细胞凋亡,且具有时间依赖性,PGE2-PLGA-MSs对凋亡的促进作用低于等浓度的PGE2、PGE2+HAP;0.05 mol/L浓度对细胞凋亡无影响。HAP对MC3T3-E1细胞的凋亡具有一定的促进作用（P<0.05）,且具有时间依赖性。5、各浓度的PGE2、PGE2+HAP和PGE2-PLGA-MSs均促进MC3T3-E1细胞分泌碱性磷酸酶（ALP）且具有剂量依赖性。其促进作用第5d时达到高峰,第7d时开始下降;缓释PGE2和PGE2+HAP的促进作用第3d时低于等浓度的PGE2,第5、7d时高于等浓度的PGE2。6、各浓度的PGE2、PGE2+HAP和PGE2-PLGA-MSs均促进MC3T3-E1细胞基质矿化且具有剂量依赖性。PGE2-PLGA-MSs和PGE2+HAP促进细胞基质矿化作用第9d时低于等浓度的PGE2,第13、15d高于等浓度的PGE2。7、于第5、7、9、11天Real-time PCR检测成骨相关基因及转录因子表达水平,PGE2、PGE2-HAP、PGE2-PLGA-MSs均促进ALP、OPN、OCN、COL-1;RUNX2、Oxteix;c-fos、c-fra1、c-fra2、jun-D、c-jun mRNA表达,抑制BSP表达;与对照组比较,PGE2-PLGA-MSs对基因表达时间延长,0.05μmol/L浓度PGE2促进基因调控因子表达的作用增强。结论1、PLGA可以负载PGE2,低分子量PLGA（IV=0.28）微球载药量及缓释效果均优于高分子量2、PGE2-PLGA-MSs在体外培养条件下具有缓释作用,可以延长PGE2对MC3T3-E1细胞的增殖、分化、成骨及相关成骨基因表达的作用时间。3、PGE2对MC3T3-E1细胞的增殖具有双向调节作用,低浓度PGE2促进细胞增殖,并呈时间和剂量依赖。本实验0.05μmol/L的浓度PGE2是促进MC3T3-E1细胞增殖的临界浓度。4、本研究浓度下PGE2、PGE2-HAP、PGE2-MSs对成骨样细胞MC3T3-E1生物学性能及相关成骨基因表达具有促进作用,抑制骨涎蛋白基因表达。5、PGE2-HAP正向促进成骨样细胞MC3T3-E1生物学性能及相关成骨基因表达。