【摘 要】
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流产衣原体（Chlamydia abortus,C.abortus）是引起绵羊地方性流产（Enzootic abortion of ewes,EAE）的主要病原体,在世界各地的流行范围极其广泛,主要可引起反刍动物的大规模流产。感染的动物会成为感染源,妊娠期妇女长期与感染源接触,可能会产生严重的腹痛、炎症或呼吸系统问题,从而导致流产、早产或死胎。流产衣原体病作为一种比较严重的人畜共患病,给全球畜牧业
【基金项目】
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陕西省重点研发计划（NO.2020NY-010,2018ZDCXL-NY-02-07）； 西安市科技计划项目（No.20NYYF0032）； 国家重点研发计划,牛羊重要病原体分子检测新技术研究（2016YFD0500907）；
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流产衣原体（Chlamydia abortus,C.abortus）是引起绵羊地方性流产（Enzootic abortion of ewes,EAE）的主要病原体,在世界各地的流行范围极其广泛,主要可引起反刍动物的大规模流产。感染的动物会成为感染源,妊娠期妇女长期与感染源接触,可能会产生严重的腹痛、炎症或呼吸系统问题,从而导致流产、早产或死胎。流产衣原体病作为一种比较严重的人畜共患病,给全球畜牧业的可持续发展和人类的健康构成了巨大威胁,研究特异、敏感且快速的诊断方法对该病的防控和流行病学调查有着重大意义。因此,本研究建立了基于衣原体蛋白酶样活性因子（Chlamydial protein-like activity factor,CPAF）基因检测流产衣原体的实时荧光定量PCR方法,建立了基于流产衣原体重组蛋白CPAF检测CPAF抗体的间接ELISA方法。具体研究成果如下:1.基于流产衣原体CPAF编码的基因建立流产衣原体的实时荧光定量PCR方法。本研究根据Gen Bank公布的不同衣原体种的CPAF核苷酸序列,设计出一组针对流产衣原体的特异性引物、探针;以构建的重组质粒p MD19T-CPAF为模板构建了该方法的标准曲线。该方法检测重组质粒的最低下限为26 copies/μL,是普通PCR灵敏性的10倍;本研究建立的实时荧光定量PCR方法与其它可以引起类似症状的病原体无交叉反应;组内和组间变异系数均小于3%;通过临床样本检测证明了本研究建立的方法适用于大规模的临床样本检测且灵敏性高于世界动物卫生组织（World Organization for Animal Health,OIE）参考推荐的荧光定量PCR方法。2.基于流产衣原体重组蛋白CPAF建立检测CPAF抗体的间接ELISA方法。本研究用纯化的重组蛋白CPAF包被酶标板,优化后的最佳反应条件是:包被条件为0.25μg/孔、4 ℃、16 h,37 ℃封闭30 min,将待检血清1:300稀释,37 ℃孵育60 min,酶标二抗1:30000稀释,37 ℃孵育45 min,37 ℃显色10 min。待检血清样本OD450值≥0.442时判定为阳性;对流产衣原体标准阳性血清的最低检测下限为1:2560;酶标板在4 ℃、﹣20 ℃或﹣70 ℃条件下保存至少3个月;组内组间重复试验的变异系数均小于8%;临床样本检测结果显示,本研究建立的方法比间接血凝试验（Indirect hemagglutination,IHA）灵敏度高,并可确定IHA检测结果中属于“可疑”样本的阴阳性,该方法与国外进口试剂盒检出率一致,但成本更低,说明本研究建立的方法更适用于我国流产衣原体血清学的临床大规模检测。综上,本试验建立了检测流产衣原体的实时荧光定量PCR和间接ELISA方法,两种方法都具有灵敏度高、重复性好等优点,均可应用于流产衣原体病的临床诊断,并有望开发成相应的检测试剂盒,从而为流产衣原体病的高通量检测和流行病学调查提供技术支撑,为制定流产衣原体病的综合防控措施提供可行的技术方法。
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