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前言幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,H.pylori)是慢性胃炎和消化性溃疡的主要病因,并且与胃癌的发生关系密切,但是H.pylori的致病机制尚不清楚。胃蛋白酶原(pepsinogen,PG)是胃粘膜特异性功能酶-胃蛋白酶的前体,主要来源于胃体底腺的主细胞,可分为胃蛋白酶原A(pepsinogen A,PGA)和胃蛋白酶原C(pepsinogen C,PGC)两个生物学特性和免疫学特性不同的亚型。胃粘膜分泌的PG99%进入胃腔,1%进入血循环。血清PG水平可反映不同部位胃粘膜的形态和功能。关于H.pylori与血清PG关系的研究目前集中于体内研究,这些研究结果可能受到H.pylori定植部位、PG亚型来源细胞分布差异、免疫反应以及更加复杂的机体调控系统的影响。那么H.pylori对体外培养的人胃粘膜细胞PG蛋白表达的影响究竟如何?未见文献报道。PGC基因在第7-8外显子间的内含子序列存在100bp的插入-缺失片段长度多态,研究表明PGC基因多态与胃溃疡、胃癌有关,并与H.pylori在这些疾病的发生上具有交互作用,但其确切机制尚不清楚。那么H.pylori对不同PGC基因多态型人胃粘膜细胞PG蛋白表达的影响如何?目前尚不清楚。体外实验中应用的细胞大多是永生化的细胞系,是因为其具有易获取、培养省时省力、可以无限传代等优点,但是细胞系长时间的培养已经很大程度地改变了其生物学特性,这一点是细胞系作为研究模型以来一直存在的困扰性问题。原代培养细胞弥补了细胞系的不足,由于其刚离体,生物学特性未发生很大变化,仍具有二倍体遗传物性,最接近和反映体内生长特性。胃粘膜细胞原代培养是近三十年来尤其是上世纪八九十年代由于基础研究和临床治疗的需要以及细胞培养技术的发展而发展起来的,其来源涉及鼠、兔、犬、人等多个种属。通过对原代培养胃粘膜上皮细胞的评价,发现其体外功能与体内胃上皮细胞有很多相似之处。H.pylori是胃粘膜的损伤因子,是胃粘膜病变的始动因素,在细胞水平上研究H.pylori在胃疾病发生机制中的作用,前提是能够获得与人体胃粘膜损伤十分相近的H.pylori诱导损伤模型,但是目前还没有这样理想的实验模型。本研究拟通过H.pylori与原代培养的人胃粘膜细胞共培养观察H.pylori对胃粘膜细胞的损伤作用,建立H.pylori诱导的原代培养人胃粘膜细胞损伤模型,初步探讨H.pylori对原代培养的人胃粘膜细胞及不同PGC基因多态型人胃粘膜细胞PG蛋白表达的影响,以期为研究H.pylori损伤胃粘膜细胞及细胞抗H.pylori损伤的机制提供实验依据。目的建立H.pylori诱导的原代培养人胃粘膜细胞损伤模型;明确H.pylori对原代培养的人胃粘膜细胞PG蛋白表达的影响;明确H.pylori对不同PGC基因多态型人胃粘膜细胞PG蛋白表达的影响。方法本研究采用脑心浸液琼脂培养基进行H.pylori复苏培养;采用原代细胞培养技术进行人胃粘膜细胞的培养;采用细菌与细胞共培养方法,通过倒置显微镜观察细胞损伤的形态学改变,通过乳酸脱氢酶(lactic dehydrogenase,LDH)试剂盒检测细胞外LDH活力;采用序列特异性引物-聚合酶链反应(PCR)方法检测PGC基因多态型,采用酶联免疫吸附试验(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)方法检测细胞培养上清中PG蛋白含量,计算加菌前后PG蛋白表达变化率=(加菌后PG蛋白表达量-加菌前PG蛋白表达量)/加菌前PG蛋白表达量。结果1.H.pylori诱导原代培养人胃粘膜细胞损伤模型的建立①正常胃粘膜细胞的原代培养胃粘膜细胞接种第2天细胞呈团簇状生长,团簇越多越密集,细胞增殖越快、数量越多;第3天细胞增殖迅速,以细胞簇为中心向外周生长,与附近的细胞群相连成片;第4天细胞铺满皿底约70%,细胞生长状态良好,单层贴壁生长,呈菱形或多边形,核大呈卵圆形。②H.pylori诱导原代培养人胃粘膜细胞损伤作用的观察H.pylori与胃粘膜细胞以100:1的比例共培养6小时造成了细胞的损伤:细胞间隙扩大,连接松弛,细胞表面肿胀、不规则,细胞轮廓变模糊,细胞周围碎片增多,细胞膜、核膜变粗糙,可见空泡变性,细胞形态发生损伤改变。LDH活力测定结果显示6’h LDH活力远高于3’h和对照组,而与9’h基本相同。2.H.pylori对原代培养人胃粘膜细胞PG蛋白表达的影响加菌组胃粘膜细胞PGA蛋白表达(247.0±104.5 ug/1L)高于对照组(239.7±107.8 ug/1L,P=0.90),PGC蛋白表达(43.6±53.3 ug/1L)高于对照组(31.2±23.6 ug/1L,P=0.56)。各组间差异无统计学意义。3.H.pylori对不同PGC基因多态型人胃粘膜细胞PG蛋白表达影响携带PGC等位基因310的原代培养胃粘膜细胞加菌前后PGA蛋白表达变化率(0.20±0.21)高于其他型(-0.01±0.07,P=0.11),PGC蛋白表达变化率(0.36±0.22)高于其他型(0.23±0.71,P=0.73)。各组间差异无统计学意义。结论1.成功建立H.pylori诱导的原代培养人胃粘膜细胞损伤模型。2.H.pylori可以上调原代培养的人胃粘膜细胞PGA、PGC蛋白表达。3.H.pylori对不同PGC基因多态型人胃粘膜细胞PG蛋白表达的影响不同,携带PGC等位基因310的胃粘膜细胞PG蛋白表达受H.pylori影响强于其他型。