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甘蔗(Saccharum spp.L.)是广泛种植于热带及亚热带地区的多年生禾本科植物,是世界第一大糖料作物。由革兰氏阳性细菌Leifsonia xyli subsp.xyli(Lxx)引起的甘蔗宿根矮化病(Ratoon stunting disease,RSD)在甘蔗产区普遍发生,严重影响甘蔗生长进而造成产量和经济损失。前人的研究多集中在RSD的发生与检测、病原菌Lxx的分离培养及RSD胁迫下甘蔗的超微结构观察,且目前有关甘蔗与RSD互作的分子机制研究多是对Lxx侵染下甘蔗差异表达基因的克隆与不同胁迫处理下的定量表达研究。由于Lxx难于实现体外分离培养和对其进行遗传操作,故而也限制了Lxx与甘蔗互作机理的研究。本研究通过对甘蔗接种诱导,观察和测定了Lxx侵染对甘蔗生长和生理生化代谢的影响;以高感RSD甘蔗品种Badila为材料,利用RNA-Seq与DIA技术分析了在响应RSD病原菌胁迫过程中,甘蔗叶片与茎的m RNA及蛋白表达水平的变化;利用i TRAQ技术,分析了甘蔗感染RSD后的磷酸化蛋白质表达变化;利用转基因技术对病原菌Lxx18460基因(anti-sigma K factor,Rsk A)的功能进行了初步探究。主要的研究内容与结果如下:1.以果蔗拔地拉(Badila)和桂糖11号(GT11)健康种茎为实验材料,通过接种Lxx纯培养菌液作为RSD染病处理。利用病原菌Lxx的特异性基因Lxx18460,基于实时荧光定量PCR和Western Blot技术分析了该基因在甘蔗感染RSD后50 d、180 d、210 d的表达情况。结果表明,接种Lxx后,随着甘蔗的生长,Lxx18460在转录水平和蛋白水平表达逐渐升高。在此期间,Lxx侵染下的甘蔗较对照植株的株高、茎径、单茎重、水势以及半胱氨酸和甲硫氨酸含量均下降,而膜透性和游离氨基酸、钙调素含量增加;同时,抗性基因PAL、ZFP和NBS-LRR在转录水平的相对表达量也在Lxx侵染后上调表达。2.用Lxx菌液接种Badila和GT11健康种茎,通过对两个甘蔗品种四个时期的细胞壁组分进行测定,结果显示,在Lxx侵染下,Badila染病植株叶片的纤维素、半纤维素和果胶含量分别较对照植株下降14.88%、13.74%和11.17%,胼胝质和木质素含量分别较对照植株上升13.13%和15.29%;在GT11中,染病叶片的纤维素、半纤维素和果胶含量分别较对照植株下降7.43%、5.43%和16.7%,胼胝质和木质素含量分别较对照植株上升17.45%和15.07%。受Lxx侵染后,Badila在其工艺成熟期时地上部分干物质积累总量、全氮积累总量、全磷积累总量、全钾积累总量较对照植株分别显著下降53.5%、12.8%、11.7%、7.4%,而GT11分别下降21.8%、33.8%、6.5%、5.7%,两个品种间具有显著性差异。3.以高感RSD甘蔗品种Badila为材料,对接种Lxx后90 d的叶片与蔗茎基部样品用Illumina RNA-Seq进行测序。结果表明,RSD染病叶片较对照叶片相比共有11,802个差异表达基因,其中7,721个上调表达基因,4,081个下调表达基因;染病蔗茎与对照蔗茎相比共有9,325个差异表达基因,其中4,426个上调表达,5,059个下调表达。这些差异表达基因在甘蔗叶片和茎中所起的生物学功能和参与的代谢途径不同,综合来看,主要在光合作用、植物与病原菌相互作用中的信号通路、植物激素与次生代谢及细胞壁相关途径响应RSD胁迫。4.在转录组学的基础上,利用DIA技术对同样处理的甘蔗品种Badila的实验材料进行蛋白质组学分析。结果表明:12个甘蔗样品中共鉴定到的蛋白数量为9,702个,RSD染病叶片与对照叶片的差异表达蛋白有98个,其中上调表达蛋白40个,下调表达蛋白58个;蔗茎中筛选到的差异表达蛋白有407个,其中上、下调表达蛋白分别为179个和228个,说明甘蔗茎较叶片在蛋白水平更为积极和敏感地响应Lxx的侵染。综合叶片与蔗茎中的差异表达蛋白分析结果,这些蛋白显著富集于植物激素信号转导、苯丙素和谷胱甘肽生物合成、植物与病原菌互作途径等,这些代谢通路直接或间接参与甘蔗对RSD的响应。甘蔗叶片蛋白质组与转录组的差异表达的关联性为0.1545,而蔗茎中的差异表达关联性为0.3076。甘蔗叶片和茎中分别有11个和38个差异表达蛋白与转录组中的差异表达基因相关联,其中有7个和27个差异表达蛋白分别与各自的差异基因表达趋势相同,且大部分的关联差异蛋白与植物激素信号转导、植物与病原菌互作和植物次生代谢物合成等相关。5.利用i TRAQ技术对甘蔗感染RSD后的Badila蔗茎基部进行了磷酸化蛋白组研究。结果表明:6个甘蔗样品中共鉴定到3,924个磷酸化肽段,有3,326个磷酸化位点定位在1,879个磷酸化蛋白上。甘蔗茎在Lxx侵染90 d后与对照植株有114个差异磷酸化肽段,其中有63个表达上调,51个表达下调。对差异磷酸化蛋白的Pathway进行富集分析,结果显示,富集到差异磷酸化蛋白数目较多的通路是代谢途径、次生代谢物合成和植物病原菌互作,其中丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢和精氨酸生物合成为显著富集通路。6.利用转基因烟草对甘蔗宿根矮化病菌膜蛋白基因Lxx18460(anti-sigma K factor)进行了研究,转化Lxx18460后的烟草植株较野生型相比,植株生长高度降低,叶面积变小,生物量下降。净光合速率降低、内源激素合成受到抑制。Lxx18460基因主要在烟草茎中高度表达,在植株生长过程中,该基因在转录和翻译水平的表达随着时间的推移而稳定增加,其表达减缓了烟草植株的生长。Lxx18460基因表达量越高,对烟草的影响越明显。构建了受Ubi启动子控制的单子叶植物表达载体p UBTC-Lxx18460,通过农杆菌介导转化法进行甘蔗的遗传转化,将目的载体导入甘蔗品种ROC22中。经过组织培养和后期筛选,经PCR检测和Western Blot检测确证获得了转Lxx18460基因甘蔗,蛋白质检测结果也说明该基因已经在转化植株中正确表达为相应的蛋白。总之,本研究通过分析Lxx侵染甘蔗导致的生理及病理变化,探讨了甘蔗对RSD响应的生理和分子机制,并且对Lxx18460基因功能进行了初步的探讨,这些工作使我们能够更深入地了解甘蔗对RSD的应答机制,为研究RSD与甘蔗互作提供参考。