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随着工农业的发展,重金属等污染物导致的水环境污染越来越严重,分子生物标记常常被用来指示和检测水体中重金属污染状况,金属硫蛋白(Metaliothionein,MT)就是其中最重要的生物标记之一。鳜(Siniperca chuatsi Basilewsky,1855)和斑鳜(S. scherzeri Steindachner,1892)是我国重要的名贵淡水养殖鱼类,对水质变化非常敏感,因此,本文以这两种鱼类为材料研究了鳜和斑鳜MT-2的基因结构,并检测了鳜组织中金属硫蛋白的表达情况,用以评价其在重金属污染检测中的应用。
鳜MT-2 cDNA序列全长为388 bp。其中5端、3端非编码区分别为49bp和156bp,开放阅读框包含183 bp,编码60个氨基酸。获得的鳜MT基因组全长为865bp,包含三个外显子和两个内含子。扩增得到的启动子长1466bp,启动子区域含有典型的顺式作用元件-金属反应元件(Metal response element,MRE),并分为三簇;含有TATA盒和激活蛋白(Activator proteinl,AP1),缺乏GC盒。
斑鳜MT-2基因组全长865bp,和鳜MT-2相比,只有外显子上少数几个碱基的差异,也包含有三个外显子和两个内含子。扩增得到的启动子长1167bp,包含的金属反应元件同样分成三簇,含有AP1和糖皮质激素应答元件(Glucocorticoid Response Element,GRE)等。
对鳜MT-2转录和表达产物的器官组织分布进行了详细的分析。real-timePCR的检测表明该基因受Cd2+诱导后,mRNA表达水平在鳃和脑组织中显著上升,在肌肉、肝脏和肾脏组织中表达水平变化不显著。构建了pET-32a(+)-MT-2原核表达质粒,通过原核表达、表达蛋白纯化,并制备多克隆抗体,对鳜的组织鳃、肝脏、心脏、肾脏、肌肉、头肾、脑、脾脏和肾脏等器官中的目的基因蛋白进行免疫印迹分析。Westernblotting结果显示,健康鳜组织中,鳃、肝脏、心脏、肾脏、肠道中MT-2表达量比较高,肌肉和脑组织中表达量比较低,头肾和脾脏中几乎检测不到MT-2的表达。对肝脏和肾脏组织进行免疫组织化学检测,在肝脏组织的染色中,MT-2分布在肝细胞的胞浆里;肾脏组织中,MT-2主要分布在肾脏近端小管和远端小管的上皮细胞胞浆内。