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国兰通常是指兰科兰属(Cymbidium)植物中的一部分地生种,包括墨兰、建兰、春兰、寒兰、蕙兰、莲瓣兰和春剑,具有很高的观赏价值和经济价值。为了解国兰花期调控的分子机理,本研究分别从墨兰品种“企剑白墨”(Cyvmbidium.sinense‘Qi Jian Bai Mo’)和变种“秋榜”(Cymbidium.sinense var.haematodes)、建兰品种“金丝马尾”(Cymbidium.ensifolium‘Jin Si Ma Wei’)、春兰野生种(Cymbidium.goeringii)中克隆到光周期调控途径中的关键基因CONSTANS-like(COL),并对其表达特性及功能进行了初步研究。主要研究结果如下:
1.根据兰科植物中蝴蝶兰的肌动蛋白(ACTIN)基因序列设计两对跨内含子引物,分别以cDNA第一链和基因组DNA为模板,采用RT-PCR和PCR的方法从上述四种材料中分离出ACT基因片段。将企剑白墨、秋榜、建兰和春兰的ACT基因片段分别命名为CsACT1、CsACT2、CeACT1和CgACT1(GenBank登录号分别为GU181353、HM204766、GU181354和GU181355)。序列分析显示:CsACT1和CgACT1均为1335 bp,其中编码区长度均为1088 bp,编码362个氨基酸,包含3个内含子；CsACT2和CeACT1均为1202 bp,其中编码区长度均为1044 bp,编码348个氨基酸,包含2个内含子。氨基酸序列的同源性分析显示这四个基因片段的同源性非常高,达到97％以上；它们与其它植物的肌动蛋白基因也有较高的同源性,其中与蝴蝶兰ACT的同源性最高,达96％以上。进化树结果显示它们与蝴蝶兰的ACT亲缘关系最近,其次为禾本科植物的ACT。RT-PCR表达分析结果显示,这四个基因在根、茎、叶、花梗、花蕾以及所有花器官中都有表达,且表达量一致,由此确定它们在器官中是组成型表达,可以作为基因表达调控研究中的内标参照。
2.采用RT-PCR和RACE相结合的方法,首先从企剑白墨中克隆到COL基因,命名为CsCOL1(GenBank登录号为GU168786)。该基因的全长cDNA序列为1186 bp,其中ORF为981 bp,编码327个氨基酸。根据CsCOL1的核苷酸保守序列设计特异引物,分别以cDNA第一链和基因组DNA为模板,从秋榜、建兰和春兰中克隆到COL基因,分别命名为CsCOL2、CeCOL和CgCOL(GenBank登录号分别为HM204765、GU181352和GU181351)。其中CsCOL2和CeCOL的ORF均为984 bp,编码328个氨基酸；CgCOL的ORF为981 bp,编码327个氨基酸。这四个基因的DNA序列均包含两个外显子和一个简单的内含子,内含子大小均为98 bp。
3.氨基酸结构域分析显示,这四个COL基因都具有COL家族的结构特征,即包含两个B-box锌指结构域和一个CCT结构域。氨基酸序列的同源性分析显示,这四个基因的同源性非常高,达到97％以上；它们与其它植物的COL也有较高的同源性,其中与蝴蝶兰COL的同源性最高,为84～85％；与水稻Hd1、拟南芥AtCO的同源性也分别在42％和38％。系统进化树分析表明,它们与蝴蝶兰COL的亲缘关系最近,其次为大麦的COL,同处于CO基因家族的第一组群。
4.实时定量RT-PCR分析结果显示,CsCOL1在根、茎、叶中均有表达,且在叶片中的表达最强,在根中的表达最弱。当植株开花后,CsCOL1在所有的花器官中都有表达,其中在花瓣和萼片中的表达量最高。昼夜节律表达分析结果显示,CsCOL1、CeCOL和CgCOL的表达水平在长日照和短日照下都呈现24小时一个周期的变化。长日照下,这三个基因的表达量在光照12 h时达到最高峰；短日照下,CsCOL1和CeCOL的表达量在黑暗处理12～16 h时达到最高峰,而CgCOL的表达量则在黑暗处理4 h达到最高峰。此外,CsCOL1和CeCOL在长日和短日下的表达强度无明显差异,而CgCOL在LD下的表达量高于在SD下的表达量。
5.利用载体pBI121,构建了35S::COL的超表达载体,将35S::CsCOL1通过叶盘法转入烟草中。表型观察发现T0代转CsCOLJ1烟草与野生型相比平均提前15天开花。