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神经病理性疼痛(Neuropathic pain)是指:周围和(或)中枢神经系统、原发和(或)继发性损害、功能障碍或短暂性紊乱引起的疼痛。可表现为感觉迟钝(dysesthesia)、感觉异常(paraesthesia)、痛觉过敏(hyperalgesia)和痛觉超敏(allodynia)。去神经后疼痛综合征(如:幻肢痛)是神经病理性疼痛的一种常见类型,见于截肢或去神经支配患者,严重影响患者的生活质量。由于其基本病理生理机制不明,缺乏特异性治疗措施,镇痛治疗患者满意度不高,是困扰医学界的一大难题。目前认为,幻肢痛的发生与中枢一系列不恰当的可塑性反应,即中枢敏化关系密切。中枢敏化是指外周神经损伤后,中枢感觉神经系统的神经元和感觉神经回路兴奋性的持续性增强,感受阈值降低,感受野扩大。中枢敏化以突触传递的长时程增强(long term potentiation, LTP)为特征,LTP的形成伴随有脊髓背角内突触前囊泡蛋白合成的增多及低阈值的Aβ纤维从脊髓背角的第Ⅲ层长芽至第Ⅱ层。上述突触可塑性的变化可能导致脊髓背角内突触数量的增加。但目前并无对脊髓背角内突触具体数量进行定量的研究报道。小胶质细胞和星形胶质细胞在中枢敏化中的重要作用日益受到重视。目前认为:神经病理性疼痛的发生和维持过程存在胶质细胞与神经元之间的“对话”。胶质细胞可通过直接调节突触的数量和突触间隙的神经递质水平,或通过其分泌的炎性介质和神经营养因子间接的作用于感觉神经元,导致感觉神经元兴奋性改变。研究已经证实外周神经损伤只会激活脊髓背角内的小胶质细胞。由于星形胶质细胞的活化依赖于小胶质细胞的活化,因此,外周神经损伤后胶质细胞的活化主要存在于脊髓背角内。受损神经的炎症反应是脊髓背角内小胶质细胞和星形胶质细胞活化的主要诱发因素,可引起胶质细胞胞体肥大和数量增多。然而,外周神经完全横断后炎症反应很轻,其脊髓背角内胶质细胞的活性和数量变化可能不同于其他类型的神经损伤,其中枢敏化的表现形式可能也不同。遗憾的是,目前尚无研究对此作出报道。如上所述,外周神经损伤后,突触、小胶质细胞和星形胶质细胞在中枢敏化的形成中有着重要的作用,其数量的改变势必影响神经损伤后慢性疼痛的发生及程度。目前尚缺乏对其数量进行准确定量的研究。此外,截肢(外周神经横断)所致的神经损伤方式有别于其他类型的损伤,其中枢可塑性改变可能也与其他类型的神经损伤不同,从而导致其治疗方式的不同。本研究采用新的体视学方法和新的体视学技术——光学体视框结合特异性染色方法来对单侧坐骨神经横断后脊髓背角内神经元、突触、小胶质细胞和星形胶质细胞的数量进行定量研究,以期为幻肢痛相关的中枢可塑性表现提供新的解剖学资料和基础指标。积极的治疗截肢后的急性疼痛,可预防或减轻幻肢痛。文献报道:常用于术后镇痛治疗的特异性环氧化酶(Cyclooxygenase, COX)-2抑制剂——帕瑞昔布具有抑制中枢敏化的作用,因此本研究同时观察了帕瑞昔布对坐骨神经横断后疼痛相关行为学表现和上述各种粒子数量的影响。体视学形态定量研究的主要研究对象是组织病理切片,组织在包埋和染色过程中的脱水处理会造成组织明显皱缩。因此,在进行形态定量研究时必须考虑皱缩对结果的影响。本研究将首先采用设计依赖体视学(design-based stereology)结合Cavalieri’s原理,估计包埋和染色后组织体积的皱缩系数及长度的压缩系数,对后续的形态定量结果进行校正,以获得更准确的形态学定量资料。第一部分目的以设计依赖体视学结合Cavalieri’s原理,研究石蜡包埋和切片染色对大鼠脊髓腰膨大体积及长度的影响。对后续的形态定量结果进行校正,以获得更准确的形态学定量资料。方法4%多聚甲醛经心脏灌流固定后取大鼠脊髓腰膨大(L4-6),称重、测量长度并以比重法测定其密度。重量除以密度即可得到固定后体积。将腰膨大均分为6段,随机抽取其中一段用石蜡包埋。垂直于脊髓长轴方向切取厚度(H)为14μm的连续切片。按等距随机原则每15张抽取一张切片,第一张切片在第1~15张中随机抽取。选中的切片HE染色,Visiopharm体视学设备测定脊髓横截面面积(a)和染色后灰质的厚度和白质的厚度,并计算切片的平均厚度(h)。A乘以H(14μm)即可得到包埋后脊髓腰膨大的体积;A乘以h即可得到染色后脊髓腰膨大的体积。用包埋后和切片染色后腰膨大的体积除以其包埋前的体积,即为石蜡包埋和切片染色后组织的皱缩系数。用染色后长度除以固定后长度即可得到染色后的压缩系数。结果大鼠脊髓腰膨大固定后体积为96.80±13.85mm2 ,长度为1.53±0.25cm。石蜡包埋后体积为60.19±19.15 mm2,显著低于固定后体积(P<0.05)。染色后体积为42.97±16.02mm2,灰质长度为0.85±0.17cm,白质长度为1.00±0.18cm,显著低于固定后体积和长度(P<0.05)。石蜡包埋后和切片染色后脊髓的皱缩系数分别为62.9%±20.5%和44.8%±16.6%,长度的压缩系数灰质为56.9%±17.1%,白质为66.7%±19.5%。结论石蜡包埋和染色处理将造成大鼠脊髓腰膨大的体积明显皱缩和长度明显压缩,形态定量研究必须考虑到组织皱缩和压缩对结果的影响。第二部分目的采用设计依赖体视学结合光学体视框,探讨大鼠单侧坐骨神经横断所致的去神经后疼痛综合征是否存在脊髓背角内神经元、突触、小胶质细胞和星形胶质细胞数量的可塑性变化。方法健康成年SD大鼠11只随机分为2组:(1)假手术组及(2)单侧坐骨神经横断组。术后隔天观察动物的行为学改变(自噬)并评分。术后28d处死动物,取其腰膨大(L4-6)进行石蜡包埋及切片,并分别行尼氏染色(以显示和计数神经元)、突触素(synaptophysin)免疫组化染色(以显示和计数突触数量)、离子钙接头蛋白-1(ionized calcium bindingadaptor molecular-1, iba-1)免疫组化染色(以显示和计数小胶质细胞)和胶质纤维酸性蛋白(glia fibrillary acidic protein, GFAP)免疫组化染色(以显示和计数星形胶质细胞)。以光学体视框(一种新的体视学技术)估计脊髓背角内神经元、突触、小胶质细胞和星形胶质细胞的数量。结果(1)单侧坐骨神经横断后,大部分动物出现自噬,评分9-11分。(2)单侧坐骨神经横断会导致手术侧脊髓背角内突触数量显著增加(P<0.05)及小胶质细胞和星形胶质细胞数量显著降低(P<0.05)。与非手术侧相比,手术侧L4-6脊髓中间段组织单位长度(1mm)的脊髓背角内突触数量增加了74.3%;小胶质细胞数量减少了44.9%,星形胶质细胞数量减少了35.8%。L4-6脊髓的吻侧和尾侧节段无上述变化。结论去神经后疼痛大鼠脊髓背角内会发生结构上的可塑性改变,表现为突触数量显著增加,及小胶质细胞、星形胶质细胞数量的减少。上述结构可塑性可能是导致去神经后疼痛综合征形成中枢敏化的结构基础。第三部分目的研究单侧坐骨神经横断术后早期运用特异性COX-2抑制剂帕瑞昔布镇痛治疗对去神经后疼痛大鼠脊髓背角内突触、小胶质细胞及星形胶质细胞数量的影响。方法健康成年SD大鼠13只随机分为2组,分别行(1)单侧坐骨神经横断术,及(2)单侧坐骨神经横断术后3d连续给予帕瑞昔布腹腔注射。术后隔天观察动物的行为学改变(自噬)并评分。动物处死、组织切片的抽取及脊髓背角内突触、小胶质细胞、星形胶质细胞计数同第二部分。结果(1)帕瑞昔布术后早期镇痛在一定程度上可缓解大鼠自噬程度(2)术后早期使用帕瑞昔布对去神经后疼痛大鼠脊髓背角内突触数量的可塑性无显著影响(P>0.05),但可一定程度的抑制脊髓背角内胶质细胞数量减少的程度(手术侧脊髓背角内小胶质细胞和星形胶质细胞数量较非手术侧分别减少了29.9%和20.2%)(P<0.05)。结论术后早期使用帕瑞昔布可在一定程度上缓解去神经后疼痛,其作用可能与其抑制小胶质细胞和星形胶质细胞数量可塑性改变有关。