【摘 要】
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β-葡聚糖酶在食品、饲料、发酵、生物能源甚至垃圾处理等领域发挥着日益重要的作用。但迄今所报道的多数β-葡聚糖酶的酶活较低、耐热性较差,极大地限制了 β-葡聚糖酶的应
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β-葡聚糖酶在食品、饲料、发酵、生物能源甚至垃圾处理等领域发挥着日益重要的作用。但迄今所报道的多数β-葡聚糖酶的酶活较低、耐热性较差,极大地限制了 β-葡聚糖酶的应用。为了获得具有更好耐热能力的β-葡聚糖酶,本研究以疏绵状嗜热丝孢菌为出发菌株,在毕赤酵母异源表达β-葡聚糖酶基因。主要研究内容如下:根据疏绵状嗜热丝孢菌基因组测序的注释信息,利用RT-PCR技术成功扩增出2个外切β-葡聚糖酶基因和1个内切β-葡聚糖酶基因:glnB、glnD和glnE,其大小分别为1260 bp,2694 bp和1938 bp;利用MEGA 6.0软件生成系统发育进化树,分析表明这些基因与已报道的β-葡聚糖酶基因的亲缘关系较远。利用毕赤酵母表达系统,构建了 3个产β-葡聚糖酶的酵母重组菌株(GS-glnB,GS-glnD,GS-glnE)。以海带多糖为底物测定重组外切β-葡聚糖酶GlnB和GlnD的酶活分别为11.5 U/mL和3.25 U/mL。通过SDS-PAGE电泳检测重组酶蛋白分子大小分别为44.0 kDa和93.4 kDa,与预测大小相符。GlnB的最适反应温度为65℃,在50℃条件下保温2 h保留95%的活性;其最适pH为5.0,在pH 3.0-9.5之间有较好的稳定性。GlnD的最适反应温度为70℃,在55℃保温2 h仍保留90%的活性;其最适pH为2.5,在pH 1.5-4.0之间有较好的稳定性。以羧甲基纤维素钠为底物,用粘度法测定内切β-葡聚糖酶GlnE的相对酶活。在50℃的条件下,其相对活力为202 U/mL。通过SDS-PAGE电泳验证内切β-葡聚糖酶基因glnE编码的蛋白大小为68.7 kDa,与预期大小相符。
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