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脊髓损伤（spinal cord injury, SCI） 的救治一直是医学领域的难点、重点之一。目前，主要的研究策略有：（i） 挽救受损神经元，减少其迟发性损伤和死亡；（ii）应用刺激神经生长的因子和/或阻断抑制轴突生长和延伸物质的作用，促进受损轴突的再生；（iii） 组织或细胞移植（包括胚胎脊髓、神经干细胞、嗅鞘细胞、雪旺氏细胞移植或外周神经等）替代神经缺损，重建损伤脊髓的解剖连接；（iv）修复损伤的髓鞘和恢复损伤区神经纤维的冲动传导性；（v）促进残存的、未受损神经纤维的侧枝出芽和突触的传导功能，增强中枢神经系统的可塑性变化。中枢神经系统（central nervous system, CNS）的可塑性是指在一定的条件下，如内外环境变化或受到伤害时，CNS具有结构与功能相应变化的能力。近年来，对SCI，特别时不完全性脊髓损伤（incomplete spinal cord injury, iSCI）后的可塑性变化（plasticity）的研究日益增多，以期给SCI的治疗提供一个新的方向。大量的临床观察及动物实验证实，iSCI从伤后数天至伤后数年均可发生不同程度的自发性功能恢复。可塑性变化是iSCI数周至数年后自发性功能恢复的主要机制，它可发生在大脑皮层、皮层下结构及脊髓本身及外周效应器四个水平。主要包括三种类型的可塑性变化：1、改变现存通路的突触传递效率；2、通过“侧枝出芽”及结构重排形成新的通路；3、激活损伤前就存在的、功能处于静止状态的且未受损的神经传导通路，如交叉膈神经支配现象。其中，“侧枝出芽”普遍存在于CNS，是一种重要的可塑性变化形式，与学习记忆、技能形成、损伤修复及某些病理状态的形成有密切关系。虽然成年动物在SCI后也可发生一定程度的可塑性变化，但这种能力随年龄的增长而下降。一般认为，这除了与成年动物神经元本身固有的特性有关外，还与成年动物CNS中抑制再生的抑制因子相对较多，及神经营养因子相对缺乏有关。一些实验表明，外源性神经营养因子可增强SCI后的可塑性变化和功能恢复。目前，利用腺病毒载体，介导外源性基因在神经系统组织和细胞长时间高效转移和表达，增强神经再生和可塑变化的能力，已成为治疗神经系统损伤和疾病的常用方法。横断大鼠或猫等低等动物的低位胸髓后，它们可自发地部分恢复其行走功能，而踏<WP=11>步训练可大幅地促进其功能恢复。这一作用被认为与存在于腰髓中的“中枢型式发生器”（central pattern generator, CPG）的作用有关，而且脊髓内抑制性递质系统的变化参与了这一调节过程。那么，颈段脊髓损伤后，功能训练是否能促进肢体功能，特别是前肢精细运动功能的恢复，是值得探讨的问题。目前尚未见相关文献报道。本实验的主要目的是探讨腺病毒介导的脑源性神经营养因子（brain-derived neurotrophic factor, BDNF）和心肌营养素-1（cardiotrophin-1, CT-1）基因转移及前肢功能训练对大鼠颈段脊髓不完全损伤后可塑性变化及功能恢复的作用。实验共分为三部分：第一部分，扩增、纯化和鉴定AxCA-BDNF 、AdCMV-huCT1重组腺病毒载体；第二部分，建立大鼠红核和颈段dCST联合损伤模型，并改进大鼠前肢食物小球抓取动作的评分标准；第三部分，探讨腺病毒介导的BDNF和huCT1基因转移及前肢功能训练对大鼠颈段脊髓不完全损伤后可塑性变化及功能恢复的作用，及其可能机制。主要方法及技术路线：1. 以293细胞为扩增细胞，大量扩增重组腺病毒载体（recombinant adenovirus vector，RAD）。裂解293细胞后，CSCL密度梯度离心纯化RAD。病毒原液转染293细胞和NIH3T3细胞，采用PCR，RT-PCR和免疫组化鉴定所得RAD，并测定其滴度；2. 立体定位仪引导下，奎宁酸注入大鼠双侧红核，自制小钩致伤皮质脊髓背侧束（dorsal corticospinal tract, dCST），建立大鼠颈段dCST和红核联合损伤模型。生物素化葡聚糖胺（biotin dextran amine, BDA）注入感觉运动皮层示踪皮质脊髓腹侧束（ventral corticospinal tract, vCST）的“出芽”情况。同时，改进大鼠前肢食物小球抓取动作的评分标准；3. 在大鼠颈段dCST和红核联合损伤模型的基础上，将大鼠随机分为5组：正常对照组（normal, N组），损伤对照组（injury, I组），BDNF治疗组（BDNF组）， CT-1治疗组（CT-1组）和功能训练组（training, T 组）。BDNF组和CT-1组在致伤后，SCI局部分别施用AxCA-BDNF 和AdCMV-huCT1重组腺病毒，T 组在损伤后3天开始前肢食物小球抓取训练。设1w，2w，4w，8w四个时相点。伤后1周， RT-PCR鉴定RAD在脊髓中的表达；各时相点，免疫组化观察皮层CST投射神经元GAP43和P75NTR、损伤脊髓处GAD67、BDNF和CT-1的表达；BDA示踪vCST的“出芽”情况；荧光金逆行标记CST投射神经元（corticospinal neurons, CSNs）存活情况；改进后的大鼠前肢食物小球抓取动作的评分标准和运动诱发电位评价大鼠前肢功能变化。主要结果及结论：1. 经扩增和纯化，共得到AdCMV-huCT1纯化病毒80(l，滴度介于1.0×1010-3.3×1011<WP=12>PFU/ml，AxCA-BDNF纯化病毒60(l，滴度介于0.7×1010-2.6×1011 PFU/ml。纯化病毒液稀释后，转染体外培养的NIH3T3细胞和大鼠脊髓，PCR，RT-PCR和免疫组化结果显示，重组腺病毒载体携带外源性基因，且能在NIH3T3细胞和?