论文部分内容阅读
戊型肝炎病毒(HEV)引起的戊型肝炎是一种严重危害公众健康的全球性传染病，主要经胃肠道传播。我国新疆南部曾因水源污染发生过世界上规模最大的戊型肝炎暴发流行，有约12万人发病。近年来我国戊型肝炎的小规模流行和散发病例也有明显增加。卫生部公布的疫情报告把戊型肝炎列为发病明显上升的病种。世界卫生组织已将戊型肝炎疫苗列为21世纪最优先发展的疫苗之一。
由于HEV细胞培养十分困难，故难以研制传统的灭活疫苗或减毒活疫苗。国内外研究者多致力于基因工程重组蛋白疫苗的研发。但是，与HEV自然感染方式不同，现有的HEV重组蛋白疫苗大多经注射途径免疫，通常不能诱导机体产生胃肠道局部粘膜免疫反应，而粘膜免疫在阻断类似戊型肝炎等的胃肠道传染病的发病中具有重要作用。因此研制一种接种方便、价格低廉、易于推广、能同时诱导粘膜和系统免疫的戊型肝炎粘膜疫苗意义重大。
将腺苷酸环化酶基因(cya)和环化Amp受体蛋白基因(crp)缺失突变的减毒鼠伤寒沙门杆菌作为疫苗载体用于疫苗研发，其可行性已被大量研究证实。本实验室在国内外首次成功构建了能够稳定表达含HEV中和抗原表位的ORF2编码蛋白片段的戊型肝炎减毒鼠伤寒沙门杆菌疫苗株X4550(pYA3341-179)，初步研究结果显示该疫苗菌能够诱导小鼠产生特异性体液免疫和粘膜免疫。本研究旨在通过不同免疫剂量，不同免疫途径，研究戊型肝炎减毒鼠伤寒沙门杆菌疫苗X4550(pYA3341-179)在小鼠体内的免疫效果，确定优选的免疫策略，达到适当的免疫原性和低副作用之间的最佳平衡，为戊型肝炎减毒鼠伤寒沙门杆菌疫苗的进一步研发奠定基础。
本研究分为两部分：
一、戊型肝炎减毒鼠伤寒沙门杆菌疫苗X550(pYA3341-179)的安全性研究
分别以口服和鼻饲两种方式免疫小鼠，剂量为10<3>CFu、10<7>CFU、10<10>CFU，于第4、8周加强免疫2次，通过监测小鼠的各项生理指标，找出疫苗接种剂量的安全范围。结果发现在观察期内无小鼠死亡。与鼻饲PBS对照组相比，鼻饲10<3>CFU、10<7>CFU两组生存状态良好，而鼻饲10<10>CFU组小鼠首次免疫后就出现明显的体重下降，差别具有统计学意义，并出现竖毛、厌食、不活跃等现象，提示鼻饲免疫时剂量过高会影响小鼠的生理状态。而口服各组小鼠对所给剂量的耐受性较好，只有口服10<10>CFu组小鼠免疫后出现了一过性体重下降。
二、戊型肝炎减毒鼠伤寒沙门杆菌疫苗X550(pYA3341-179)不同免疫途径和剂量的免疫效果研究
分别以口服和鼻饲两种方式免疫小鼠，剂量为10<3>CFu、10<7>CFU、10<10>CFU，于第4、8周加强免疫2次，通过检测各组小鼠产生的血清抗HEV-IgG及其亚类，粪便抗HEV-sIgA以及细胞免疫水平，评价疫苗的免疫效果，确定合适的免疫剂量和免疫途径。结果发现各疫苗接种组小鼠均产生了全面的免疫应答包括体液免疫、细胞免疫和粘膜免疫。无论是口服组还是鼻饲组，血清抗HEV-IgG和粪便抗HEV-sIgA的高低与剂量都有一定的相关性。其中口服10<10>CFU组小鼠粪便抗HEv-sIgA显著高于10<3>CFU剂量组(P<0.05)；鼻饲10<10>CFU和10<7>CFU组的血清抗HEV-IgG水平均显著高于10<3>CFU组(P<0.05)；鼻饲10<10>CFU的粪便抗HEV-sIgA显著高于10<3>CFU组(P<0.05)。接种剂量为10<7>CFU时，鼻饲组的抗HEV-IgG水平比口服组高，差异具有统计学意义。在诱导小鼠产生粪便抗HEV-sIgh方面，等剂量接种的鼻饲组均优于口服组，但是差异没有统计学意义。血清IgG2a/IgGl的检测结果显示，各组小鼠血清IgG都是以IgG2a亚类为主，免疫应答具有Th1方向优势。另外本研究还进行了口服和鼻饲10<10>CFU两组小鼠的脾淋巴细胞特异性增殖实验，结果发现两组小鼠均产生了强烈的特异性脾淋巴细胞增殖反应。
总之，由于10<10>CFU鼻饲接种时会影响小鼠的生理指标，10<7>CFU和10<10>CFU剂量诱导的免疫应答水平之间没有显著性差别，因此鼻饲优选10<7>CFU。而口服免疫时，小鼠能够耐受高至10<10>CFU剂量的疫苗菌，并且10<10>CFU组小鼠粪便抗HEV-slgA显著高于10<3>CFU剂量组(P<0.05)，因此口服优选剂量为10<10>CFU。鼻饲10<7>CFU组与口服10<10>CFU组相比，两组的血清抗HEV-IgG和粪便抗HEV-slgA均无显著性差异。