论文部分内容阅读
飞蝗作为昆虫学研究的模式生物，是一种重要的世界性农业害虫。飞蝗基因组信息和RNA干扰技术在飞蝗中的应用为研究飞蝗的功能基因和发展新的害虫防治方法提供了更多的机会。基因组定向敲除技术的使用进一步地拓展了飞蝗的基础和应用研究。在此文中，报道了CRISPR/Cas9系统在飞蝗中的成功应用，产生了可遗传的靶向基因的突变并成功构建了嗅觉缺失的突变系。 设计gRNA用来靶向嗅觉受体共受体(Orco，odorant receptor co-receptor)基因，来尝试基因组编辑技术在飞蝗上的效果并研究嗅觉受体通路的功能。利用CasOT软件预测后获得了134个gRNAs并根据其在Orco基因组上的位置和低的脱靶率，挑选了两个gRNAs进行实验操作。将Cas9-mRNA和gRNA的混合物显微注射到蝗虫卵中，利用PCR测序和TA克隆的方法检测突变。其中一个成功的gRNA(Orco-gRNA)导致的G0代蝗虫的突变率为71.7％，而传递到G1代中的突变率高达88.1％。随后，利用合理的杂交策略成功建立了稳定的Orco突变系。 触角电位测定(EAGs，electroantennograms)和单个感觉毛细胞电生理记录(SSRs，single sensillum recordings)实验表明四龄的Orco纯合型突变体蝗蝻失去了对多种气味的电生理反应能力。 进一步分析了三种基因型个体在嗅觉行为和表型方面的差异变化。在嗅觉行为实验中，相比于野生型和杂合体对聚集信息素产生的吸引反应，Orco突变体并没有对聚集信息素产生任何选择性的反应。然而，对于运动能力和体色两种表型，Orco纯合型突变体与杂合型和野生型蝗虫相比，三者之间没有显著差异。 通过用CRISPR/Cas9系统产生功能缺失的突变体的研究，为研究蝗虫功能基因和控制农业害虫提供了重要的前景。