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支气管哮喘(简称哮喘),是最常见的气道慢性炎症性疾病之一,严重威胁着人类的健康。目前全世界约有3亿哮喘患者,其中中国有3千万左右,虽然发病率不高,但是病死率却居高不下。哮喘是以嗜酸性粒细胞,肥大细胞,T淋巴细胞等气道局部浸润为主,主要表现为气道高反应性,粘液高分泌和可逆性的气流受限。传统的变态反应型哮喘气道炎症主要表现为2型辅助性T(Th)细胞、嗜酸性粒细胞和激活的肥大细胞的增多以及Th2型细胞因子(IL-4、IL-5和IL-13等)的大量分泌。近年来一些研究表明一些新的细胞类型如TH17细胞,Treg细胞,DC细胞等,新型的细胞因子如IL-25, IL-33, TSLP在哮喘气道炎症的发生发展过程中也发挥着关键的调控作用,然而哮喘发病的分子学机制至今仍未完全阐明。细胞自噬是机体一种重要的保护和防御机制,在机体维持内稳态和适应微环境改变的过程中发挥着非常重要的作用。在某些特定的环境(如饥饿,生长因子缺乏,缺氧)下,细胞内可以形成一种双层膜的囊泡结构,该囊泡结构可以捕获细胞内受损的细胞器(如线粒体,内质网,高尔基体等)和变性的蛋白质,形成细胞自噬体,然后细胞自噬体可以与细胞内的溶酶体结合成自噬溶酶体,进而在溶酶体内各种水解酶的作用下,将其内的细胞器和生物大分子消化降解,从而为新的生物大分子合成提供原料和能量。细胞自噬过程(包括细胞自噬体的形成,细胞自噬体捕获受损的细胞器和生物大分子的过程)受多种分子调控,这些分子统称为Atg (autophagy-related)家族。其中Beclin-1(又称为Atg6)在细胞自噬体形成过程中发挥着关键作用,而LC3B(Atg8的同源蛋白)则在细胞自噬体捕获受损细胞器和生物大分子的过程中非常重要,脂质化的LC3BⅡ与LC3B本体LC3BI的比例已经被公认为是WesternBlot检测细胞自噬的金标准。除此之外,目前已发现30种以上的Atg基因和蛋白与细胞自噬的分子机制有关。虽然细胞自噬有利于维持机体内环境的稳定,但是,在特定的情况下,细胞内大量细胞器和生物大分子的消耗会导致其死亡,称之为细胞自噬死亡。所以在不同的情况下,细胞自噬可以保护细胞,也可以促进细胞死亡,因此在不同疾病的发病过程中细胞自噬发挥着不同的作用。目前越来越多的研究证明细胞自噬在多种呼吸系统疾病的发病过程中有重要的调控作用,如慢性阻塞性肺疾病(COPD),肺动脉高压,急性肺损伤,囊性纤维病等,然而,关于细胞自噬在支气管哮喘发病过程中的作用却鲜有研究报导。本实验分两部分进行研究：(1)利用细胞自噬相关基因敲除小鼠LC3B-/-构建OVA诱导的哮喘气道炎症模型阐明细胞自噬在OVA诱导的哮喘气道炎症中的调控作用及其机制；(2)利用细胞自噬相关基因敲除小鼠LC3B-/-构建HDM诱导的哮喘气道炎症模型阐明细胞自噬在HDM诱导的哮喘气道炎症中的调控作用,并通过骨髓移植技术探究细胞自噬在HDM诱导的哮喘气道炎症中的作用机制。第一部分细胞自噬在OVA诱导的哮喘气道炎症中的调控作用及机制目的：研究细胞自噬在OVA诱导的哮喘气道炎症中的调控作用及其机制。方法：健康的雄性C57BL/6小鼠,相同周龄的雄性LC3B-/-小鼠,分别随机分为生理盐水对照组(WT/NS和LC3B/NS)和哮喘模型组(WT/OVA和LC3B/OVA).哮喘模型组以卵白蛋白(OVA)致敏和激发建立哮喘模型生理盐水对照组则以同等剂量的生理盐水代替OVA,于最后一次OVA激发后24小时后处理小鼠,检测其肺泡灌洗液内炎症细胞的总数,嗜酸性粒细胞比例及绝对值,肺组织HE染色观察气道炎症浸润的情况,PAS染色观察粘液的分泌情况,肺组织mRNA检测一些炎症因子的表达,ELISA检测肺泡灌洗液内炎症因子的分泌。体外利用IL-13干预人肺上皮细胞BEASE-2B, Q-PCR检测IL-25分泌的变化,。OVA干预人气道上皮细胞HBE, Western Blot检测LC3B表达的变化。结果：LC3B敲除后明显缓解OVA诱导的哮喘气道炎症,肺泡灌洗液中炎症细胞总数,嗜酸性粒细胞比例和绝对值都明显减少,肺部炎症浸润明显缓解,粘液分泌明显下调,肺泡灌洗液中炎症因子的分泌,肺组织炎症因子的表达也明显下降。体外IL-13干预人气道上皮细胞BEASE-2B均能诱导IL-25表达的增加,然而敲除自噬相关基因之后IL-25的表达则会明显下调。且OVA干预人气道上皮细胞HBE可以明显诱导LC3B表达的增加。结论：细胞自噬相关基因LC3B敲除可以缓解OVA诱导的小鼠气道炎症,可能是通过抑制IL-25,IL-33等炎症因子的分泌从而减轻气道上皮细胞损伤实现的。第二部分细胞自噬在HDM诱导的哮喘气道炎症中的调控作用目的：研究细胞自噬在OVA诱导的哮喘气道炎症中的调控作用。方法：健康的雄性C57BL/6小鼠,相同周龄的雄性LC3B-/-小鼠,分别随机分为生理盐水对照组(WT/NS和LC3B/NS)和哮喘模型组(WT/HDM和LC3B/HDM)。哮喘模型组以气道滴注尘螨提取物(HDM)致敏和激发建立哮喘模型,生理盐水对照组则以同等剂量的生理盐水代替HDM。于最后一次HDM激发后48小时后处理小鼠,检测其肺泡灌洗液内炎症细胞的总数,嗜酸性粒细胞比例及绝对值,肺组织mRNA检测一些炎症因子的表达,ELISA检测肺泡灌洗液内炎症因子的分泌。建立骨髓移植模型,将LC3B-/-骨髓移植到WT小鼠体内,观察骨髓内敲除LC3B对哮喘表型是否有影响。然后将WT骨髓回输到LC3B-/-小鼠体内,观察对于LC3B-/-小鼠的哮喘表型是否有一定的“挽救”作用。结果：LC3B敲除后明显缓解HDM诱导的哮喘气道炎症,肺泡灌洗液中炎症细胞总数,嗜酸性粒细胞比例和绝对值都明显减少,肺泡灌洗液中炎症因子的分泌,肺组织炎症因子的表达也明显下降。将LC3B-/-小鼠骨髓移植到WT小鼠体内(相当于骨髓特异性敲除LC3B),对HDM诱导的哮喘气道炎症有一定的缓解作用；然而将WT-小鼠骨髓移植到LC3B-/-小鼠体内,对于LC3B-/-小鼠的表型并没有明显的“挽救”作用。结论：细胞自噬相关基因LC3B敲除可以缓解HDM诱导的小鼠气道炎症,其调控作用主要在气道上皮细胞层面,不依赖于骨髓。