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研究背景肝纤维化是指当肝脏受到各类有害因素的损伤时,细胞外基质(extracellular matrix,ECM)沉积而导致肝脏正常结构和功能发生改变的病理过程。多种慢性肝病均可经此过程并最终进展为预后极差的肝硬化和肝癌。所以,针对肝纤维化的早期诊断和治疗成为研究的重中之重。而目前为止,肝穿刺仍为诊断肝纤维化的金标准,但因其有创性而得不到广泛、及时实施,在一定程度上耽误了患者的早期诊治。虽已有肝纤维化无创性早期诊断的方法,但均不十分理想,新的更有效的手段亟待被发现,这就有必要对肝纤维化发生发展的分子机制行进一步深入研究。miRNA(micro RNA)是一段大小约20~25个核苷酸序列的小分子片段,其在真核细胞中广泛存在,可通过负向调控其靶基因参与多种疾病的发生和进展,且在内分泌、心血管和肿瘤等多种研究领域受到广泛关注。目前亦有多种研究表明miRNA与肝纤维化发生密切相关,其可通过影响肝星状细胞(hepatic stellated cell,HSC)的活化、增殖、凋亡、迁移等细胞学功能,在肝纤维发生及进展过程中起促进或抑制作用。本课题组多年来一直从事miRNAs与肝纤维化发生发展的分子机制研究,前期工作发现:miR-484在DMN诱导的大鼠肝纤维化模型中呈显著性差异表达,且相关文章已经发表。本研究为进一步探讨miR-484是否对HSC细胞功能学产生影响,通过提取原代HSC,检测到miR-484在HSC自然活化过程中表达呈上升趋势。并通过生物信息学和双荧光素酶报告基因实验筛选并验证得知HIPK1(homeodomain interacting protein kinase 1,同源结构域交互蛋白激酶1)为miR-484的靶基因。已有研究表明,HIPK1可调控细胞增殖、分化、凋亡等多种生物过程。本研究中同样发现miR-484可通过靶向HIPK1促进HSC活化并抑制其凋亡,且在此过程中伴有Wnt/β-catenin信号通路的激活,若在疾病早期对miR-484的表达进行抑制,或许可阻遏肝纤维化进程。研究目的本研究在前期工作的基础上,旨在进一步探讨miR-484参与肝纤维化形成的具体分子机制。共包括三个部分:(一)检测miR-484在大鼠原代HSC自然活化过程中的表达变化;(二)miR-484靶基因的筛选及验证;(三)miR-484对HSC活化和凋亡的信号通路机制研究。研究方法一、检测miR-484在大鼠原代HSC自然活化过程中的表达变化(一)提取大鼠原代hsc,以自发荧光实验鉴定所提细胞的纯度;将培养2天内的细胞作为静止态,培养至14天的细胞作为完全活化态,并用免疫荧光实验鉴定细胞状态;(二)qrt-pcr检测原代细胞不同时期mir-484的表达水平。二、mir-484靶基因的筛选及验证(一)以mir-484为关键词,在microrna.org、mirbase、targetscan等网站进行了靶基因预测,并对感兴趣的靶基因进行geneontology(go)分析,发掘其可能参与的功能;(二)双荧光素酶报告基因验证mir-484与hipk1之间是否存在直接靶向关系。(三)利用hsc-t6细胞株进行转染实验,将mir-484inhibitor/mimics及其阴性对照转染入细胞48h后,提取细胞总蛋白。利用westernblot技术检测hipk1是否被mir-484负向调控;三、mir-484对hsc活化和凋亡的信号通路机制研究(一)在hsc-t6细胞株中转染mir-484inhibitor后,qrt-pcr和westernblot检测不同分组之间肝纤维化相关指标α-平滑肌肌动蛋白(α-smoothmuscleactin,α-sma)和?型胶原(type?collagen,col?)表达变化;(二)在hsc-t6细胞株中转染mir-484inhibitor后,利用qrt-pcr和westernblot技术检测wnt-3a、wnt-5a、β-catenin表达是否发生相应改变,以检测mir-484对hsc细胞功能的调控,是否通过wnt/β-catenin信号通路实现;(三)annexinv-fitc/pi双染法用以检测不同分组之间细胞凋亡的差异。四、统计学方法:计量资料用均数±标准差表示;两组数据之间比较采用t检验;统计软件采用spss21.0;统计学显著性定义为p<0.05。研究结果一、mir-484在大鼠原代hsc自然活化过程中的表达变化(一)自发荧光实验鉴定结果提示所提原代hsc的纯度可达90%以上,2天内静止态的细胞呈椭圆形,脂质含量丰富,在328nm波长紫外光照射下,可发射出黄绿色荧光;培养至14天达到完全活化状态,细胞延展生长,呈星状;免疫荧光实验显示活化态细胞中α-sma表达量明显升高;(二)qrt-pcr结果提示,相对于静止态,活化态hsc中mir-484表达呈显著性升高(p<0.05)。二、mir-484靶基因的筛选与验证(一)生物信息学分析结果提示,hipk1与mir-484在3’utr区域存在两个结合位点;(二)双荧光素酶报告基因验证miR-484与HIPK1之间确实存在靶向关系;(三)Western Blot结果表明,在HSC-T6细胞株中转染miR-484 inhibitor后,HIPK1在蛋白水平表达明显上调;而转染miR-484 mimics后,HIPK1在蛋白水平表达明显下调。三、miR-484对HSC活化和凋亡的信号通路机制研究(一)相对于阴性对照组,转染miR-484 inhibitor后48h,HSC-T6细胞株中α-SMA和col?在mRNA和蛋白水平表达均明显下降(P<0.05);而空白对照组与阴性对照组表达则无明显差异(P>0.05);(二)转染miR-484 inhibitor后,Wnt/β-catenin信号通路相关分子Wnt-3a、Wnt-5a、β-catenin表达下降(P<0.05);(三)人为下调miR-484后,流式细胞仪检测得HSC-T6细胞凋亡率明显升高(P<0.05)。结论一、miR-484在原代HSC自然活化过程中表达升高;二、HIPK1是miR-484的直接靶基因;三、miR-484靶向HIPK1促进HSC活化并抑制其凋亡,使得细胞外基质合成增多,促进肝纤维化形成及进展;四、miR-484靶向HIPK1对HSC细胞功能的调控,可能是通过Wnt/β-catenin信号通路实现的。