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甲基营养菌能够利用单碳化合物作为唯一碳源和能源进行生长代谢,已有相关研究报道该类细菌能够利用廉价的低碳化合物生产高价值的代谢产物,包括L-丝氨酸。L-丝氨酸的用途广泛,研究通过微生物发酵生产L-丝氨酸并提高其产量具有重要意义。在氨基酸发酵生产中,解除产物的反馈抑制是提高产物产量的重要手段之一。3-磷酸甘油酸脱氢酶(3-PGDH)催化L-丝氨酸生物合成的第一步反应,也是该合成途径的限速反应；其活性受到该途径终产物L-丝氨酸反馈抑制调控。通过分子改造得到解除反馈抑制效应的突变体酶有利于L-丝氨酸的积累。本实验室前期工作对L-丝氨酸耐受性突变体进行筛选并克隆到编码3-PGDH的serA基因。本研究利用生物信息学预测,并参考文献,预测3-PGDH碳端调控区的His360、Asn362、Asn380三个氨基酸残基位点是L-丝氨酸结合关键位点。通过丙氨酸扫描法进行定点突变,研究突变酶的L-丝氨酸反馈抑制效应,以期鉴定出L-丝氨酸与3-PGDH结合关键位点。通过丙氨酸替换突变位点,构建了突变酶S1(H360A)、S2(N362A)、S3(N380A)、S4(H360A/N362A)、S5(N362A/N380A)、S6(H360A/N380A)、 S7(H360A/N362A/N380A)。在BL21(DE3)-pET-30a (+)表达系统中诱导表达,诱导条件为：温度20℃、IPTG终浓度0.25mM,时间20h,转速120rpm。在非变性条件下,利用NTA-镍离子螯合亲和层析柱纯化蛋白酶。发现蛋白酶S1(H360A)、S2(N362A)、S3(N380A)几乎完全解除了L-丝氨酸反馈抑制作用,且它们的酶活性降低(分别为野生型的52%,61%,62%)；蛋白酶S4(H360A/N362A)的L-丝氨酸反馈抑制作用无明显解除,但酶活性降低(为野生型的79%)；突变酶S5(N362A/N380A)、S6(H360A/N380A)及S7(H360A/N362A/N380A)则失去酶催化活性。结论：甲基营养菌MB200中3-磷酸甘油酸脱氢酶调控区His360、Asn362、Asn380三个氨基酸残基与其L-丝氨酸反馈抑制作用相关,且与酶催化活性有关。