论文部分内容阅读
目的：肺纤维化（pulmonaryfibrosis，PF）是以肺泡间质炎症细胞浸润、纤维细胞增生和细胞外基质进行性沉积为主要特征的慢性间质性肺疾病。其发病机制还不十分清楚，目前尚无理想的治疗方法。基质金属蛋白酶组织抑制因子(tissueinhibitorofmetal-oproteinases，TIMPs)作为MMP-13的组织特异性拮抗剂，在肺纤维化疾病的发生发展过程中有其独特的作用。以往研究表明，MMP-13与TIMPs之间的失衡是导致肺纤维化的重要机制之一。
本实验观察Ba对BLM模型大鼠肺纤维化形成早期及晚期阶段肺内MMP-13含量和活性及TIMPs活性的影响，以阐明黄芩苷防治肺纤维化的机制，为此药的临床应用提供实验资料。
方法：明胶酶谱法检测MMP-13含量和活性；反义酶谱法检测TIMPs的活性；用天狼猩红组化染色和肺组织羟脯氨酸(hydroxyproline，HYP)含量测定，判断大鼠肺纤维化程度；HE染色观察大鼠肺组织的形态学改变，并为天狼猩红组化染色胶原含量测定提供部位依据。
将60只健康清洁级大鼠随机分为三组：1.动态观察组(n=12:分7d，14d和28d3个时间点。大鼠分别于气管内一次性滴注BLM(5mg/kg)或NS（0.5ml/kg）后第8d，15和29d被处死取肺，用于检测MMP-13含量和活性及TIMPs的活性。2.早期给药组（即1-14d给药组）(n=16)：其中14dNS+14dNS大鼠(n=3)于气管内一次性滴注NS(0.5ml/kg)后，每天腹腔注射NS(1ml/kg)，连续14天；14dM+14dNS大鼠(n=8)于气管内滴注BLM(5mg/kg)后，每天腹腔注射NS(1ml/kg)，连续14天；14dM+14dBa大鼠(n=5)气管内滴注BLM(5mg/kg)后，每天腹腔注射Ba(12.5mg/kg)，连续14天。此组大鼠于气管给药后第15d取肺，肺组织分别用于检测MMP-13含量和活性及TIMPs活性、形态学观察（天狼猩红和HE染色）。3.晚期给药组（即14-28d给药）(n=32)：其中28dNS+后14dNS大鼠(n=9)在气管内一次性滴注NS(0.5ml/kg)后第14d至28d期间，每天腹腔注射NS(1ml/kg)；28dM+后14dNS大鼠(n=10)在气管内一次性滴注BLM(5mg/kg)后第14d至28d期间，每天腹腔注射NS(1ml/kg)；28dM+后14dBa大鼠(n=13)于气管内一次性滴注BLM(5mg/kg)后第14d至28d期间，每天腹腔注射Ba(12.5mg/kg)。大鼠均在气管滴注后第29d取肺，分别用于检测MMP-13含量和活性及TIMPs活性、形态学观察（天狼猩红染色和HE染色）以及羟脯氨酸含量的测定。
JEDA-801D形态学图像分析系统计算肺组织胶原天狼猩红染色的阳性面积百分比；Alpha分析软件分析MMP-13的含量和活性及TIMPs的活性。采用SPSS-13.0统计软件，MMP-13的含量和活性及TIMPs的活性的数据通过秩转换结合完全随机设计方差分析来进行组间差异的两两比较以P＜0.05作为判断差异显著性的标准。HYP和胶原含量的所有数据用均数±标准差(x±SD)表示，采用SPSS-13.0统计软件，多个样本均数比较用单因素方差分析(One-WayANOVA)，多个样本均数间的两两比较用最小显著差法（leastsignificantdifference，LSD），以P＜0.05作为判断差异显著性的标准。
结果：1.一般情况观察在观察期间，14dNS+14dNS大鼠和28dNS+后14dNS大鼠均表现活泼，反应灵敏，皮毛光滑。14dM+14dNS大鼠和28dM+后14dNS大鼠活动迟缓，毛发晦暗竖立，并伴有喘息，食欲差，体重低。14dM+14dBa大鼠和28dM+后14dBa大鼠均食欲，毛色，体重及活动情况较BLM大鼠有所好转。
2.肺纤维化形成中肺MMP-13和TIMPs活性的变化。
2.1MMP-13活性的动态变化：BLM大鼠肺MMP-13的活性在气管滴注BLM后第7d即有升高，14d达高峰，此后开始下降。
2.2TIMPs活性的动态变化：与NS大鼠相比，BLM大鼠肺TIMP-1的活性在气管滴注BLM后第7d增强，14d减弱，28d仍减弱。而TIMP-2和TIMP-3的活性第7d减弱，14d增强，28d又开始减弱。
3.Ba对肺纤维化形成早期肺MMP-13含量和活性及TIMPs活性的影响3.1早期肺MMP-13含量和活性的变化：与14dNS+14dNS大鼠相比，14dM+14dNS大鼠肺MMP-13含量升高（P＜0.01）、活性增强(P＜0.01)。与14dM+14dNS大鼠相比，14dM+14dBa大鼠MMP-13虽含量有所升高、活性有所增强，但其差异尚无统计学意义（均P＞0.05）。
3.2早期肺TIMPs活性的变化：与14dNS+14dNS大鼠相比，14dM+14dNS大鼠肺TIMP-1、TIMP-2和TIMP-3活性差异均无统计学意义（均P＞0.05）。与14dM+14dNS大鼠相比，14dM+14dBa大鼠TIMP-1TIMP-2和TIMP-3活性差异均无统计学意义(均P＞0.05)。
4.Ba对肺纤维化形成晚期肺MMP-13含量和活性及TIMPs活性的影响4.1晚期肺MMP-13含量和活性的变化：与28dNS+后14dNS大鼠相比，28dM+14dNS大鼠肺MMP-13含量明显降低(P＜0.05)，而活性的差异无统计学意义(P＞0.05)。与28dM+后14dNS大鼠相比，28dM+后14dBa大鼠MMP-13含量升高(P＜0.001)、活性增强(P＜0.01)，并与28dNS+后14dNS大鼠的差异均无统计学意义（均P＞0.05）。
4.2晚期肺TIMPs活性的变化：与28dNS+后14dNS大鼠相比，28dM+后14dNS大鼠肺TIMP-1、TIMP-2和TIMP-3活性差异均无统计学意义（均P＞0.05）。与28dM+后14dNS大鼠相比，28dM+后14dBa大鼠TIMP-1、TIMP-2和TIMP-3活性差异均无统计学意义（均P＞0.05）。5.Ba对肺纤维化形成早期肺组织形态学和肺间质胶原的影响5.1HE染色后肺组织形态学观察结果：14dNS+14dNS大鼠肺结构正常，无炎症表现；14dM+14dNS大鼠肺泡间隔明显增宽，成纤维细胞和胶原基质明显增多，局部有肺实变。与14dM+14dNS大鼠相比，14dM+14dBa大鼠肺组织形态学没有明显减轻。
5.2天狼猩红组化法检测结果：14dNS+14dNS大鼠、14dM+14dNS大鼠肺间质胶原面积百分比分别为(0.47±0.06)和(1.04±0.06)。与14dNS+14dNS大鼠比较，14dM+14dNS大鼠肺间质胶原面积明显增大(P＜0.001)，且与14dM+14dNS大鼠比，14dM+14dBa肺间质胶原面积百分比(0.99±0.03)的差异无统计学意义(P＞0.05)。
6.Ba对肺纤维化形成晚期肺组织形态学及肺间质胶原的影响6.1HE染色后肺组织形态学结果：28dNS+后14dNS大鼠肺结构正常，无炎症表现；28dM+后14dNS大鼠肺间质细胞数目明显增多，肺泡壁增厚，肺泡腔塌陷，肺泡融合，肺泡结构消失，局部有肺实变，间质纤维化瘢痕形成。与28dM+后14dNS大鼠比较，28dM+后14dBa大鼠肺组织形态学改变明显减轻。
6.2天狼猩红组化法检测结果：28dNS+后14dNS大鼠、28dM+后14dNS大鼠肺间质胶原面积百分比为分别为(0.46±0.01)，(1.8±0.11)。与28dNS+后14dNS大鼠比较，28dM+后14dNS大鼠肺间质胶原面积增大（P＜0.001）。与28dM+后14dNS大鼠比，28dM+后14dBa大鼠肺间质胶原面积百分比(0.52±0.07)明显减小（P＜0.001），且与28dNS+后14dNS大鼠的差异无统计学意义(P＞0.05)。
6.3羟脯氨酸检测结果：28dNS+后14dNS大鼠、28dM+后14dNS大鼠肺内HYP含量分别为[(3.65±1.05)μg/mglungweight]和[(7.61±1.27)μg/mglungweight]。与28dNS+后14dNS大鼠比较，28dM+后14dNS大鼠肺内HYP含量显著增高(P＜0.001)。与28dM+后14dNS大鼠相比，28dM+后14dBa大鼠肺内HYP含量[(4.45±1.11)μg/mglungweight]明显降低(P＜0.001)，且与28dNS+后14dNS大鼠比，其差异无统计学意义（P＞0.05）。
结论：1.在肺纤维化的早期阶段(1-14d)，Ba对模型大鼠肺MMP-13含量和活性及TIMP-1、TIMP-2和TIMP-3活性的变化均无明显的影响；对肺间质胶原面积的变化亦无明显影响。
2.在肺纤维化的晚期阶段(14-28d)，Ba完全阻止了模型大鼠肺内MMP-13含量的减少和活性的降低，但对TIMP-1、TIMP-2和TIMP-3活性的变化均无明显影响。
3.Ba阻止模型大鼠肺纤维化晚期肺间质胶原的增多。由此推测，Ba纠正肺纤维化晚期MMP-13/TIMPs的失衡，是其防治肺纤维化形成的机制。