【摘 要】
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目的:人们对猪肉品质的追求随着生活质量的提升越来越高,改善猪肉品质、提高瘦肉率成为当前畜牧育种的主要方向。有研究报道,肌内脂肪(IMF)是影响猪肉品质的关键因素。另有研
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目的:人们对猪肉品质的追求随着生活质量的提升越来越高,改善猪肉品质、提高瘦肉率成为当前畜牧育种的主要方向。有研究报道,肌内脂肪(IMF)是影响猪肉品质的关键因素。另有研究证明过量摄入脂肪会导致人体肥胖,并引发脂肪肝和糖尿病等。肌内脂肪沉积受多种基因调控。肌肉生长抑制素(Myostatin,MSTN)在肌内脂肪沉积过程中发挥着重要的调控作用。据研究报道,MSTN可以通过C/EBPδ来调控脂肪前体细胞的分化,结合课题组前期试验:对敲除MSTN的猪背膘组织进行转录组和蛋白组分析,发现C/EBPδ和MMP-2/7的差异表达,同时通过软件预测到在C/EBPδ和MMP-2/7启动子区有多个结合位点。因此,我们推测MSTN可通过C/EBPδ调控MMP-2/7的表达,进而调控脂肪前体细胞分化。本研究首先在MSTN梯度敲除的细胞中检测MMP-2/7/9的表达量;其次通过在猪肌内脂肪前体细胞中过表达和干扰MSTN的表达,进一步验证MSTN和MMP-2/7/9间的相互关系,以期丰富和完善MSTN调控猪脂肪沉积的基础研究,为改良猪肉品质提供新的靶点。主要研究成果如下:1.经PCR电泳验证三种PK细胞的基因型,结果显示野生型PK15细胞的PCR产物长度为1563bp的单带;MSTN单等位基因敲除的PK3108细胞的PCR产物为1563bp和4389bp两条带;而MSTN双等位基因敲除的L18细胞的产物为1359bp和4593bp的双带。结果证明三种细胞的基因型是稳定的,可以用于后续试验。2.通过qRT-PCR和Western Blot检测三种PK细胞中MMP-2/7/9的表达水平,结果显示MSTN的缺失导致MMP-2/7/9的m RNA和蛋白表达水平均显著降低(p<0.01)。3.通过细胞形态观察和油红O鉴定证明试验成功分离出猪肌内脂肪前体细胞,且具备诱导分化为成熟脂肪细胞的能力。4.首先通过qRT-PCR和Western Blot验证在前脂肪细胞中利用重组蛋白过表达MSTN和RNAi干扰MSTN均效果显著(p<0.01),其次经qRT-PCR和Western Blot检测发现在细胞中随着MSTN的表达量增加,MMP-2/7/9的表达量也显著增加(p<0.01),随着MSTN的表达量减少,MMP-2/7/9的表达量也显著降低(p<0.01)。结论:在敲除MSTN基因的PK细胞中,MMP-2/7/9的表达水平显著下调;在肌内脂肪前体细胞中过表达和干扰MSTN表达,MMP-2/7/9的表达水平会产生相应的上调与下调。综上得出MSTN与MMP-2/7/9存在一定调控关系。
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