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对动物的深层组织成像而言，最有利于光穿透组织的光学窗口位于近红外波长区域。这意味着，要满足深层组织成像的要求，需要荧光蛋白的发射波长在更远的远红色或近红外区域。尽管几个有用的近红外荧光蛋白已经通过定向进化的方式被得到，但是对具有更优良性质（例如，发射波长更加红移、更亮的亮度、更好的单体性质）的荧光蛋白的追求和探索，仍然在延续。为了实现这些目标，我们在本研究中从两个方面去实现了荧光蛋白性质的提高。一方面是在已知最长发射波长的荧光蛋白基础上，去筛选发射光谱更加红移的荧光蛋白;另一方面是在现存的近红外荧光蛋白基础上，去筛选亮度更亮的近红外荧光蛋白。在筛选发射光谱更加红移的突变体的过程中，我们利用一种结合了随机突变筛选和基于结构的理性设计的方法，去创造光谱更加红移的突变体。首先，我们获得两个光谱红移的突变体mNeptune_G41Q和mNeptune_G41Q/C158M。在最大发射波长在670 nm以上的荧光蛋白中，它们分别展现出了最高的亮度和最高的pH稳定性。随后，通过模仿eqFP670相对于其前体Katushka具有更加光谱红移的机制，我们在突变体mNeptune_G41Q的基础上，理性地设计出了一系列最大发射在680 nm以上的近红外荧光蛋白。通过分析，我们发现在eqFP670蛋白中除了Asn143和Asn158之外，还有三个位于荧光蛋白β折叠外面的氨基酸Arg155、His157、Gln159，在氢键网络的形成过程中起着重要作用。通过Gln159主链羰基氧原子与Asn158侧链酰胺氮原子之间氢键相互作用，以及一个被Arg155稳固了构象的His157，Asn158的侧链空间构象得以稳定。另一方面，在筛选更亮的近红外荧光蛋白过程中，我们报道了近红外荧光蛋白mNeptune的Ser28被替换成His的一个单突变体。这个突变体是一个最大发射为652 nm的近红外荧光蛋白（650 nm及以上范围）;与其亲代蛋白mNeptune相比，它在提高了亮度、光稳定性和pH稳定性的同时，仍然保持着单体的性质。在本研究中，荧光蛋白的性质从以上两个方面得到了提高显示出，通过定向进化的方式提升现有近红外荧光蛋白的表现，仍然有足够的空间。