日本黄姑鱼肉活性肽的制备及其免疫调节作用研究

• 作 者: 胡旭阳
• 出 处: 浙江海洋大学
• 发表日期: 2019年01期
• 关键词: 日本黄姑鱼肉活性肽(NJP) 巨噬细胞RAW264.7 体内 免疫调节 分离纯化

日本黄姑鱼(Nibea japonica),俗称黑毛鲿,属于黄姑鱼属,主要分布在中国东海和日本南部海。日本黄姑鱼味道鲜美,营养丰富,但作为蛋白来源用于提取制备免疫活性肽的研究鲜为报道。本文以日本黄姑鱼鱼肉为原料,用酶解法提取日本黄姑鱼肉粗肽,经过超滤比较各截留组分的免疫活性,将免疫活性最高的<1 kDa的组分命名为日本黄姑鱼肉活性肽(Nibea japonica peptides,NJP)。研究NJP在体内体外水平的免疫调节作用,最后将NJP经DEAE Sepharose Fast Flow阴离子柱,Sephadex G25凝胶柱和RP-HPLC进行进一步的分离纯化。结果表明:(1)酶解法提取日本黄姑鱼肉粗肽的最佳用酶为木瓜蛋白酶。通过单因素及响应面优化,最优提取工艺参数为:料液比1:11 g/mL、pH 6、温度59°C、时间5.4 h。在此条件下,酶解肽对巨噬细胞RAW 264.7的相对增殖率为62.3%。(2)探讨NJP对巨噬细胞RAW 264.7的免疫调节作用。NJP对细胞无明显毒性,并且可显著提高巨噬细胞的增殖能力、吞噬功能、NO分泌量以及细胞因子(IL-6、IL-1β、TNF-α)的分泌水平。流式细胞术分析结果表明,NJP对细胞的增殖有良好的促进作用,且主要作用在G0/G1期。(3)进一步探讨NJP的体内免疫调节作用,同时研究NJP对环磷酰胺免疫低下小鼠的抗氧化指标的影响。结果表明,NJP可提高小鼠免疫器官指数,增强小鼠腹腔巨噬细胞吞噬能力,提高小鼠脾淋巴细胞增殖,增强迟发型变态反应的程度,提高小鼠血清中IL-2、IFN-γ、TNF-α的含量及免疫球蛋白IgA、IgM、IgG的水平,并且对小鼠免疫器官的抗氧化活性具有一定的提升作用。(4)为了进一步探讨NJP的免疫活性的有效成分,通过超滤,DEAE Sepharose Fast Flow阴离子柱,Sephadex G25凝胶柱和RP-HPLC对NJP成分进行纯化,获得了三个免疫活性肽,利用目标肽的N端测序,测得三条肽链Asp-Val-Ala-Asn,Tyr-Thr-Asn,Leu-Tyr-Gly-Asn。本课题从体内体外两个方面探索了日本黄姑鱼肉活性肽的免疫调节作用,以期为日本黄姑鱼肉的高值化利用及免疫活性肽保健食品的开发提供理论依据和技术支持。