论文部分内容阅读
阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是威胁老年人生活质量的神经退行性疾病,主要是Aβ诱导的氧化应激反应所导致神经元代谢的障碍和突触功能损伤现象。三七总皂苷(Panax notoginseng saponins,PNS)是中药三七(Panax notoginseng(Burk.)F.H.Chen.)的主要活性成分。前期实验研究已经证实PNS具有较强的抗自由基和氧化作用,能降低AD模型大鼠的氧化应激水平。然而,PNS通过氧化应激信号通路网络而治疗AD的作用机制仍不明确。目的:本课题以快速老化痴呆模型SAMP8为动物模型,观察PNS对快速老化痴呆模型SAMP8小鼠脑内氧化应激Nrf2/HO-1信号通路和JAK2/STAT3信号通路的影响,以明确PNS影响氧化应激的部位及环节,并探讨其可能的作用机制,阐明其降低氧化应激水平的作用机理为目标,为研发治疗老年性痴呆提供更多的科学依据。方法:将快速老化痴呆型SAMP8小鼠随机分为模型组、PNS高剂量组(200 mg·kg-1)、PNS低剂量组(100 mg·kg-1)、石杉碱甲组(0.03mg·kg-1),并以SAMR1为阴性对照组,每组15只/组。PNS高、低剂量组和石杉碱甲组均以双蒸水调配后灌胃给药,模型组和阴性对照组给予和药物组相同体积的双蒸水。每天灌胃1次,连续给药8周。给药完毕后,用可见分光光度法检测小鼠脑组织中总超氧化物歧化酶(T-SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)和过氧化氢酶(CAT)活性;酶联免疫吸附法检测小鼠脑组织中8-羟基脱氧鸟苷(8-OHd G)含量;HE染色法观察小鼠大脑组织中海马区域的神经元细胞的形态;实时荧光定量PCR技术检测小鼠脑内基因Nrf2、HO-1、JAK2、STAT3 mRNA的表达水平;免疫组化方法检测小鼠脑内nrf2、ho-1、jak2、sata3、p-stat3的免疫阳性细胞百分数;westernblot方法检测小鼠脑内nrf2、ho-1、jak2、p-jak2、sata3、p-stat3蛋白的表达水平。结果:1.酶活性检测结果显示:与阴性组相比,模型组小鼠脑内t-sod、gsh-px和cat活性明显下降(p<0.05);与模型组相比,pns高、低剂量组和石杉碱甲组小鼠脑内t-sod和cat活性明显升高(p<0.05或p<0.01),pns高剂量组小鼠脑内的gsh-px活性显著升高(p<0.01)。2.酶联免疫吸附法结果显示:与阴性组相比,模型组小鼠脑内8-ohdg的含量明显升高(p<0.05)。与模型组相比,pns高、低剂量组和石杉碱甲组小鼠脑内8-ohdg的含量明显下降(p<0.01)。3.he染色观察到阴性对照组神经元细胞体积大小较为统一,神经元细胞排列紧密有序,分布均匀,形态结构正常,而模型组海马区域神经元细胞减少,间隙变大,排列疏松,体积变小,pns给药组和石杉碱甲组海马区域神经元细胞均有不同程度的恢复。4.实时定量荧光pcr、免疫组化和westernblot检测pns对氧化应激nrf2/ho-1信号通路相关因子nrf2和ho-1的影响:与阴性组相比,模型组的nrf2和ho-1蛋白表达水平显著降低(p<0.05或p<0.01),pns干预后,pns高、低剂量组可上调nrf2mrna表达水平和nrf2免疫阳性细胞数(p<0.01);pns高剂量组可上调nrf2蛋白表达水平(p<0.01);pns高剂量组可上调ho-1免疫阳性细胞数和蛋白表达水平(p<0.01)。5.实时定量荧光pcr、免疫组化和westernblot检测pns对氧化应激jak2/stat3信号通路相关因子jak2和stat3的影响:与阴性组相比,模型组的stat3mrna表达水平显著升高(p<0.01),jak2、stat3和p-stat3的免疫阳性细胞数明显增多(p<0.05或p<0.01),p-jak2、stat3和p-stat3的蛋白水平表达增加(p<0.05或p<0.01);pns干预后,pns高剂量组的jak2免疫阳性细胞数明显减少(p<0.05),pns低剂量组的总jak2蛋白水平升高(p<0.01),但p-jak2蛋白水平明显降低(p<0.05),PNS高剂量的总JAK2和p-JAK2蛋白水平均明显降低(P<0.05或P<0.01);此外,PNS高剂量组可下调STAT3 mRNA水平(P<0.05),PNS高、低剂量组的总STAT3免疫阳性细胞百分比和蛋白水平均明显升高(P<0.01),但PNS高剂量组的p-STAT3免疫阳性细胞百分比和蛋白水平均显著下降(P<0.01)。结论:1.PNS可以通过提高小鼠脑内T-SOD、GSH-PX、CAT酶活性和降低DNA损伤标记物8-OHdG表达水平,最终降低小鼠脑组织受到氧化应激的损伤程度。2.PNS可上调上游Nrf2蛋白表达从而上调HO-1蛋白表达含量,起到保护细胞免受氧化氧化应激损伤的作用。3.PNS可通过降低JAK2、STAT3从而进一步使p-JAK2、p-STAT3蛋白表达水平降低,从而达到避免细胞凋亡,免受氧化应激损伤的作用。