【摘 要】
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基础胰岛素及类似药物的临床应用使糖尿病患者整体血糖得到了有效的控制。但因其作用时间短、稳定性差,以及依从性差等问题,促使研究者去开发一种作用平稳而持久、体内药效变异性小,副作用更小的新型胰岛素。德谷胰岛素即为这类新型胰岛素中的一种。本论文旨在构建重组德谷胰岛素前体蛋白的表达系统,并着重将其发酵工艺从实验室规模放大到中试规模,为实现德谷胰岛素的工业化生产打下基础。将人工合成的人胰岛素前体基因INS和
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基础胰岛素及类似药物的临床应用使糖尿病患者整体血糖得到了有效的控制。但因其作用时间短、稳定性差,以及依从性差等问题,促使研究者去开发一种作用平稳而持久、体内药效变异性小,副作用更小的新型胰岛素。德谷胰岛素即为这类新型胰岛素中的一种。本论文旨在构建重组德谷胰岛素前体蛋白的表达系统,并着重将其发酵工艺从实验室规模放大到中试规模,为实现德谷胰岛素的工业化生产打下基础。将人工合成的人胰岛素前体基因INS和HS631质粒连接为重组质粒HS631-INS,并转入大肠杆菌BL21(DE3)内,构建了稳定表达德谷胰岛素前体蛋白的重组工程菌HS631-INS/BL21。酶切图谱和测序结果显示:表达载体和前体基因大小及序列均与理论一致。前体蛋白经多步纯化得到了重组德谷胰岛素样品。质谱分析表明其分子量与德谷胰岛素理论值一致,均为5826Da。经胰岛素生物测定法检测,产物的效价为26.38IU/mg,有良好的生物学活性。在摇瓶实验中,初步比较分析了不同培养基及碳源、氮源、碳氮比和无机盐等对重组菌的菌体密度和德谷胰岛素前体蛋白表达量的影响。筛选出最适的培养基配方:葡萄糖20g/L、酵母粉5g/L、硫酸铵1.Og/L、三水磷酸氢二钾16.42g/L、磷酸二氢钾3.81g/L、七水硫酸镁4.93g/L和消泡剂0.2ml/L。在19L发酵罐上进一步系统研究了培养温度、pH、诱导剂浓度、补料培养基、补料速率和接种量等因素对菌体密度和前体蛋白表达的影响。得出最适操作参数:接种量1.0%,培养温度37.0℃、pH6.7和溶解氧浓度为30%±15%。以60%葡萄糖溶液为补料培养基,补料速率为0.5ml/min.L,诱导后补料速率为0.25ml/min.L;当菌体密度OD600达到75时,加入终浓度为0.5mmol/L的IPTG诱导,诱导时间10h。菌体密度OD600达到184.0,德谷胰岛素前体蛋白表达量为]0.45g/L,远远高于目前公开报道的通过毕赤酵母菌表达的德谷胰岛素前体蛋白水平(4.5g/L)。通过几何相似法进一步将发酵工艺逐级放大至500L发酵罐规模。3批500L发酵结果:菌体密度OD600值达到163.3,德谷胰岛素前体蛋白表达量达到10g/L。稳定性实验表明500L发酵的菌体密度和前体蛋白表达量稳定、重显性好且易操作。同时实现了原料的国产化和降低生产成本。
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