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目的：
血浆纤维蛋白原是一种急性期反应蛋白质，在体内易受遗传和环境等多种因素的影响，例如：纤维蛋白原某些基因位点的改变(遗传因素)，以及吸烟、手术或外伤、炎症、感染、AMI等应激情况(环境因素)均可使血浆纤维蛋白原水平反应性升高。近年来，大量临床和流行病学研究资料亦进一步证实了血浆纤维蛋白原水平升高是血栓性疾病的一个诱发因素，适当降低血浆纤维蛋白原对于预防心脑血管血栓性疾病是十分重要的，特别是对于高危个体状态下高纤维蛋白原血症的效果更加显著。
本课题组在以往的研究发现，我国独有的五步蛇毒中含有直接降解纤维蛋白原的成分。临床上常用的降纤酶是从蛇毒毒素中提取的蛋白质，由于自然来源的蛇毒成分与生物活性存在着地域性、季节性变异，实际上难以取得稳定的临床疗效；粗制品蛇毒中成分复杂，虽经纯化处理，仍难获得真正单一的化学成分，使临床应用中存在毒副作用；而且自然蛇毒产量有限，成本较高等缺点，引导研究方向转向用基因工程技术。目前，基因工程药物主要从大肠杆菌和酵母真核细胞中表达得到，大肠杆菌中表达的目的蛋白是以包涵体形式存在且无糖基化。甲醇营养型酵母作为一种新型外源基因表达系统，兼有原核细胞良好的可操作性和真核系统的翻译后加工的双重特点，是外源基因表达的理想宿主，本实验目的是在毕赤酵母中构建表达五步蛇毒降纤酶基因，为基因工程降纤酶的生产探索一种新方法，并研制开发出可高活性地降解纤维蛋白原的重组降纤酶，并将其开发成具有完全自主知识产权的Ⅰ类新型基因工程药物。
方法与结果：
1.五步蛇毒降纤酶基因的克隆
本实验通过五步蛇毒降纤酶抗体筛选五步蛇毒腺cDNA文库得到阳性克隆，进行测序和同源性分析确定为降纤酶基因，PCR扩增降纤酶基因(FibrinogenaseⅣ，FⅣ)，将FⅣ与质粒pPIC9K进行重组，转化大肠杆菌DH5α，进行筛选鉴定。经过酶切和DNA序列测定，证实FⅣ基因正确插入pPIC9K质粒中，成功构建重组表达质粒pPIC9K-FⅣ。
2.五步蛇毒降纤酶基因在毕赤酵母中的表达
用SacI线形化pPIC9K-FⅣ重组质粒，并用电穿孔法转染毕赤酵母KM71菌株，筛选和鉴定His+Muts转化子，提取酵母基因组DNA，PCR检测目的基因的整合，并进行表达和产物免疫印记鉴定，对FibrinogenaseⅣ基因表达结果进行初步分析，证实27kDa蛋白条带为重组五步蛇毒降纤酶(recombinationFibrinogenaseⅣ，rFⅣ)。
3.基因重组降纤酶的发酵、纯化及理化分析
在30升发酵罐上进行高密度培养发酵试验，对发酵工艺进行考察，发酵过程中酵母细胞湿重达到200-300g/L，实现高密度发酵的目的，经过36小时的甲醇诱导，表达产物活性达到最高。表达产物分别用离子交换层析和疏水层析进行纯化。对纯化产物进行等电点和糖基化检测，初步证实它为非糖基化的、等电点为7.1的重组蛋白。
4.基因重组降纤酶的酶学研究
本实验我们研究了酶活性在不同影响因素下的作用，发现基因重组降纤酶rFⅣ在30-50℃的温度处理15分钟后，相对活性仍然维持在80％以上；同时rFⅣ在pH4.5到11，相对活性维持在80％以上水平；一价金属阳离子对rFⅣ的活性没有影响，二价重金属离子(Zn2+、Cu2+和Cd2+)在1mM浓度时对rFⅣ的活性都产生了明显抑制作用，并随着浓度增加抑制作用更加明显；L-cysteine、PMSF、EDTA和DTT都可以不同程度的抑制rFⅣ的酶活性。与发色底物(N-(p-Tosyl)-Gly-Pro-Lys4-pNA)共同孵育测得的Km值是7.471×10-4mol/L，Vmax值是5.103×10-5mol/s。rFⅣ可降解纤维蛋白原的Aα、Bβ和γ链，这种降解作用随着时间和浓度的增加而增强。
5.基因重组降纤酶对高纤维蛋白原血症大鼠模型的降纤作用
为了衡量rFⅣ的急性毒性的大小，我们先测定了rFⅣ的半数致死量(LD50)，结果为LD50=62.76mg/kg。利用高纤维蛋白原血症模型研究了rFⅣ在整体动物上的降纤作用，结果显示高、中、低剂量rFⅣ均具有明显降低高纤维蛋白原血症大鼠模型的血浆纤维蛋白原作用，且这种作用随着剂量增加而增强。
结论：
1.本研究构建了pPIC9K-FⅣ重组质粒，并成功实现了基因重组降纤酶rFⅣ在毕赤酵母中的表达。为生产过程和临床应用提供了实验基础。
2.实验中构建筛选了Muts表型的FⅣ/KM71毕赤酵母表达菌株，可实现短时间、高密度、大规模发酵表达，并对其纯化工艺进行了研究，这对实现工业化生产有重要意义。
3.rFⅣ在高纤维蛋白原血症整体动物模型中有明显的降纤作用，为其在心脑血管病防治方面提供了实验基础和应用前景。