【摘 要】
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猪丁型冠状病毒（Porcine deltacoronavirus,PDCo V）是一种有囊膜结构的单股正链RNA病毒,该病毒最早被香港学者发现并报道于2012年。PDCo V最早在美国流行,该病毒对猪的各个发育阶段都易感,尤其对仔猪有很强的感染力与致病力。患病猪在临床上表现为严重的呕吐、腹泻、脱水以及嗜睡等症状;剖检患病猪可发现其胃与肠道充斥未消化完全的液体,肠壁变薄、变脆;病理组织学观察可见空肠
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猪丁型冠状病毒（Porcine deltacoronavirus,PDCo V）是一种有囊膜结构的单股正链RNA病毒,该病毒最早被香港学者发现并报道于2012年。PDCo V最早在美国流行,该病毒对猪的各个发育阶段都易感,尤其对仔猪有很强的感染力与致病力。患病猪在临床上表现为严重的呕吐、腹泻、脱水以及嗜睡等症状;剖检患病猪可发现其胃与肠道充斥未消化完全的液体,肠壁变薄、变脆;病理组织学观察可见空肠、盲肠的绒毛萎缩性肠炎,同时可以观察到盲肠和结肠的上皮细胞出现空泡化。本研究在广东省部分地区共采集到314份疑似患有PDCo V的猪腹泻病料。经过RT-PCR检测,共有42份病料被检测为阳性,阳性率为13.4%,其中有13份与PED混合感染,混合感染率为4.4%。本研究设计并合成了一套全基因测序引物,通过扩增从采集病料中选取的4份来源不同的病料,共得到2株全基因序列以及4株S基因部分基因序列。序列通过遗传进化树、同源性和预测的B细胞抗原表位等方面与各地毒株进行比较,结果表明测得的两株全基因组核苷酸与各国毒株的全基因组核苷酸同源性在88.0%～99.4%,与中国毒株最为接近,S基因上的B细胞抗原表位相关基因有部分氨基酸改变。本研究通过RT-PCR方法扩增了实验室保存的PDCo V/CHGD/2016毒株的S1基因,将所得目的片段连接到p MAL-c5x载体上,成功构建了PDCo V-S1-p MAL重组质粒。诱导后经SDS-PAGE电泳显示该蛋白约有100k D大小。为了诱导出可溶蛋白,优化了最佳的诱导浓度、诱导时间、诱导条件等,最终获得了大量可溶的蛋白。使用上述最佳诱导条件大量制备重组蛋白,浓缩后通过Western blot实验检测鉴定,结果表明目的蛋白具有良好的抗原性。将浓缩的蛋白经过亲和层析过柱纯化,最终获得了较为纯净的重组蛋白,为进一步的科学研究奠定了基础。将上述制备的重组蛋白包被后构建了一套间接ELISA检测方法,建立的最佳抗原浓度为5.5μg/m L;血清稀释度为1:200;封闭液为1%BSA;抗原包被时间2 h;一抗孵育时间1 h;二抗孵育时间1.5 h;显影时间20 min;同时测定的阴阳性临界值为0.237且重复性、特异性试验结果良好。通过检测200份患病动物血清,显示其中32份为阳性,阳性率为16%。本研究初步探索了一套有效的间接ELISA方法。
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