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发酵产品提取后的残液资源化利用是实现清洁生产的关键。电渗析具有过程简单、效率高、废物排放少等特点,为物质资源的再生和回收、酸和碱的分离和制备,实现废液的资源化和清洁生产提供了一种新途径。在电渗析处理谷氨酸发酵液的过程中,乳酸循环积累的是一个问题,它会影响电流的效率,降低膜通量。本文尝试改变中、上游操作单元的工艺参数,从发酵过程控制和菌种改造两个方面对谷氨酸发酵工艺进行改造,以解决下游提取纯化工艺中乳酸累积的问题,同时达到强化谷氨酸产酸的目的。主要研究内容和结果如下:
(1)途径分析确定L-谷氨酸的最大理论摩尔得率为100%。当草酰乙酸完全由CO2固定反应生成时,L-谷氨酸的得率为81.7%。当草酰乙酸完全由乙醛酸循环供给时,则L-谷氨酸的得率为只有54.4%。途径分析的结果表明提高磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的活性,增大CO2固定反应在草酰乙酸合成中所占的比例;减弱异柠檬酸裂解酶的活性,降低乙醛酸循环的代谢流量;同时减少或消除副产物乳酸的合成是进行谷氨酸发酵条件优化和菌种改造的重要思路。
(2)添加豆粕水解液的实验研究表明有机氮源的含量能够极大的影响谷氨酸棒杆菌发酵过程菌体内的代谢流量的分布,控制菌种的谷氨酸产酸能力。添加玉米浆的实验研究表明,适量增加玉米浆的用量可以消除副产物乳酸的生成,在一定程度上增加谷氨酸中后期的产酸能力,满足清洁生产的要求。当玉米浆过量时,会延迟菌体进入产酸期的时间,降低发酵前期的产酸量。同时发酵结束时,副产物乳酸也会相应的增加。玉米浆的最优添加策略是初始玉米浆为0.6%,发酵中后期补加0.12%,谷氨酸产量为110g/L,乳酸产量为0。
(3)过量铵离子的引入,会造成菌体内部代谢流量分布的变化,影响谷氨酸的得率。发酵前期采用醋酸钠和氨的混合溶液控制pH,降低铵离子浓度,有利于谷氨酸发酵产酸。醋酸钠与氨的最优比例为1.1g NaAc/g NH3。但是,发酵中后期继续采用限氮策略,则不能促进谷氨酸发酵产酸。
(4)目前国内外对于乙醛酸循环与谷氨酸合成关系的认识还没有明确的结论。本实验研究表明在不改变异柠檬酸节点的代谢流量分配比例的前提下,适量添加醋酸钠能够促进谷氨酸的合成。但是如果醋酸钠添加过量,强化了异柠檬酸节点进入乙醛酸循环的代谢流,那么乙醛酸循环的中间产物草酰乙酸和乙醛酸就会进一步减弱谷氨酸合成支路代谢流。
(5)苹果酸添加实验表明适量添加苹果酸能够提高谷氨酸产酸水平和糖酸转化率。可能的原因是苹果酸降低了乙醛酸循环流量,使得异柠檬酸节点进入谷氨酸合成途径的流量增加的结果。
(6)成功构建了敲除质粒pMD19-DHL∷Kan,并进行了原生质体转化实验。发酵实验结果以及PCR验证的结果表明转化实验没有成功,尚需进一步实验考察。