论文部分内容阅读
种子休眠是指有生命力的种子在适宜萌发的条件下仍不能萌发的现象。休眠是植物在长期的系统进化过程中形成的生物学特性，是控制种子在合适的时间和空间中萌发的有效机制。适度休眠也是控制作物穗萌发等灾害的关键。种子休眠受多种复杂因素的影响，其中植物激素在种子休眠过程中发挥着关键的调控作用。植物激素脱落酸(ABA)和赤霉素(GA)之间的平衡影响种子休眠的状态，此外，乙烯对种子休眠的形成和解除也至关重要。 本文以拟南芥(Arabidopsis thaliana)种子休眠突变体rdo3和乙烯途径相关基因突变体为实验材料，综合运用分子生物学、遗传学以及生物化学等方法研究了乙烯受体RDO3/ETR1调控种子休眠的分子机制。 首先，对种子休眠突变体rdo3图位克隆结果发现，RDO3为已知乙烯受体编码基因ETR1。ETR1调控种子休眠的机制已有报道，主要集中于激素间的交互作用，而对其下游关键调控因子的研究报道甚少。rdo3突变体种子的microarray基因芯片数据分析显示，乙烯途径中的相关基因MKK9、MPK14以及ERF12等的表达显著上调，表明MKK9、MPK14和ERF12可能是ETR1信号途径调控种子休眠的下游关键因子。 对KK9、MPK14以及ERF12的转基因植物表型分析发现，这些过表达植株种子休眠程度明显降低，这与rdo3突变体休眠表型趋势一致。与野生型相比，MKK9和ERF12过表达株系种子萌发对ABA或GA合成抑制剂PAC处理的敏感性没有明显差异，而MPK14过表达株系则对PAC更不敏感。这些结果表明MKK9和ERF12可能通过不依赖于ABA或者GA的乙烯信号途径行使功能，而MPK14可能部分参与了GA途径。etr1-2突变对ERF12过表达株系种子休眠没有影响，表明ERF12可能在ETR1的下游发挥功能。酵母双杂交实验以及双分子荧光互补实验证明ERF12可以与转录共抑制因子TOPLESS(TPL)互作并参与调控种子的休眠，遗传分析也表明ERF12调控种子休眠需要TPL，TPL功能缺失可导致ERF12过表达株系种子休眠表型与tpl突变体相似。tpl突变体和erf3 erf12双突变体的种子休眠程度显著高于野生型，与过表达株系种子休眠程度降低相对应，表明ERF12和TPL负向调控种子休眠。 DOG1是调控种子休眠的特异性关键因子，其在rdo3和ERF12过表达株系中的表达水平明显下调;遗传分析发现rdo3可以部分恢复近等基因系NILDOG1的休眠表型，且dog1-2突变能够导致etr1-2种子休眠完全解除，暗示RDO3/ETR1可能通过DOG1途径调控种子的休眠与萌发。通过序列分析发现，DOG1启动子含有ERF12可能结合的DRE/CRT元件。凝胶迁移电泳(EMSA)检测发现ERF12能够与DOG1启动子中的DRE/CRT元件特异性结合。此外，pDOG1∷GUS和ERF12过表达株系杂交后代的纯合体种子中GUS基因表达水平以及GUS信号明显低于亲本pDOG1∷GUS转基因株系，ERF12可能通过结合DOG1的启动子抑制其表达。 综上所述，乙烯受体RDO3/ETR1可能通过下游关键因子ERF12与TPL形成的共抑制复合体抑制DOG1表达，进而调控种子的休眠与萌发。拟南芥Ⅰ号染色体可能存在能够抑制rdo3休眠表型的抑制子。