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共轭亚油酸(Conjugated Linoleic Acid,CLA)是一类由不同位置和几何异构体组成的拥有两个共轭双键的十八碳二烯酸。它广泛存在于多种食物中,CLA具有多种生理活性,但不同类型的CLA生理活性不尽相同。本研究从两种亚油酸异构酶的克隆表达入手,比较两者差异,探索一种通过流式细胞术与绿色荧光蛋白标签质粒联合筛选正突变子的快速筛选方法,优化突变酶的产酶条件,提高t10,c12-CLA产量,研究突变酶的分离纯化条件和酶学性质,并将其应用于发酵乳中。克隆了两种亚油酸异构酶基因lai-l(ORF1776bp)和lai-p(ORF1275bp)。测序后比对发现,它们与相应的罗伊氏乳杆菌和痤疮丙酸杆菌亚油酸异构酶基因相似性为100%,说明两段基因未发生突变。lai-l与瑞士乳杆菌和加氏乳杆菌的亚油酸异构酶基因相似性为93%,两段基因彼此之间同源性很低。lai-l编码591个氨基酸,蛋白命名为LAI-L,分子量为67.9k D,等电点p I=7.14,预测为亲水性稳定蛋白。它有11个Ser,8个Thr,8个Tyr可能成为蛋白激酶磷酸化的位点,可能是膜上的受体或者定位于膜上;二级结构主要以不规则卷曲为主达47.88%,α-螺旋占34.86%,β-折叠占17.26%。lai-p编码424个氨基酸,蛋白命名为LAI-P,分子量为49.0k D,等电点p I=4.81;预测为亲水性不稳定蛋白。它有3个Ser,4个Thr,7个Tyr可能成为蛋白激酶磷酸化的位点,该蛋白应该是细胞外蛋白;二级结构主要以不规则卷曲为主达45.28%,α-螺旋占36.32%,β-折叠占18.4%。将两种亚油酸异构酶分别在大肠杆菌中表达,表达的蛋白LAI-L和LAI-P大小约为64k D和55k D;利用易错PCR法突变lai-p,构建标签表达载体p Cold-yclai-p-gfp,结合流式细胞术筛选正突变菌株,准确率达82.3%(其中7株突变菌的亚油酸异构酶的蛋白序列改变了一个氨基酸;4株突变菌的蛋白序列改变了2个氨基酸;M955蛋白序列改变了4个氨基酸,共发生7个碱基位点的突变)。其最佳诱导时间为18h,最佳诱导剂IPTG浓度为0.2mmol/L,经气相色谱鉴定M955产t10,c12-CLA,产量为68.3±2.1μg/m L。突变亚油酸异构酶最佳发酵时间为18h,最佳IPTG诱导浓度为0.2mmol/L,最佳装液量为20%,最佳培养基初始p H为7,最佳诱导前生物量为OD600=0.4,最佳底物浓度为0.5mg/m L,最佳离子浓度为0.02%的离子。响应曲面法优化最佳产酶条件为发酵时间19.5h,诱导前生物量OD600=0.47和LA浓度0.57mg/m L,亚油酸异构酶催化LA转化为CLA最大量为143.33μg/m L。采用亲和层析法对突变酶进行分离纯化,最佳流速为0.25 m L/min,最佳上样量为10 m L,纯化后的蛋白经SDS-PAGE检测可达到电泳纯。研究突变酶的酶学性质发现:米氏方程为y=0.0224x+0.0786 R2=0.9972,计算得Km为0.285mg/m L,Vmax为12.72U/mg。酶的最适反应温度为37℃、温度稳定范围为0~40℃、最适反应p H为7.0、p H稳定范围为p H5.0~9.0之间、最佳底物浓度为0.5mg/m L、金属离子对亚油酸异构酶的活性没有显著影响。将未突变和突变后的痤疮丙酸杆菌亚油酸异构酶基因转化到嗜热链球菌中。研究发现嗜热链球菌红霉素的敏感阈值为7.5μg/m L,当甘氨酸浓度为1%、菌体生长至OD600=0.8、转化电压为1.8k V、质粒浓度为1.0μg/μL、电转缓冲液选择bufferⅡ时电转化效率最高。转化菌发酵乳的性质除发酵时间比正常菌慢10%之外,其他性质如质构、粘度、粒径均与正常嗜热链球菌没有差别,检测发酵乳中CLA含量:转化菌(lai)催化LA产t10,c12-CLA=7.2μg/m L,转化菌(yclai)催化LA产t10,c12-CLA=30.2μg/m L。异源表达的突变亚油酸异构酶具有较强的产CLA的能力,因此该酶具有广阔的发展前景和应用价值。