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脂肪代谢异常,如肥胖症(Obesity)和高脂血症(Hyperlipidemia)等疾病已逐渐成为严重危害人民健康的常见疾病。脂肪是机体能量储存的一种重要方式,在细胞内中性脂肪包括甘油三酯(Triglyceride,TG)和胆固醇酯(Cholesterol Ester,CE),主要以脂滴(Lipid Droplet,LD)的形式存在,脂滴广泛地存在于多种组织细胞中,如脂肪细胞、肝细胞、肾上腺皮质和肌肉细胞等。脂滴的表面为单层磷脂结构,并且镶嵌着多种脂滴相关蛋白(Lipid Droplet Associated Proteins)。脂滴相关蛋白在脂滴的分解、合成和融合过程中具有重要的作用。PAT家族蛋白在脂滴代谢过程中具有重要作用。1990年人们发现了脂滴表面的第一个蛋白Perilipin,此后陆续发现ADRP(Adipocyte Differentiation Releted Protein)、TIP47、S3-12等许多蛋白也位于脂滴的表面,这些蛋白统称为脂滴相关蛋白。近年来蛋白质组学的研究方法应用于脂滴表面蛋白的分析,大大提高了脂滴相关蛋白发现的速度。通过蛋白质组学分析,发现不同条件下脂滴表面的蛋白种类和数量发生变化,提示这些蛋白可能是以脂滴表面为平台来发挥对脂滴代谢的调节作用。LSDP5(Lipid Storage Droplet Protein 5)是Perilipin的同源蛋白,主要分布于脂肪分解代谢速度较快的组织细胞中,如肝细胞和肌肉细胞。但是,LSDP5基因在组织中的分布、其生理和病理功能目前还不清楚。【目的】1.克隆LSDP5全长基因,获得LSDP5原核表达蛋白和抗体;2.确定LSDP5的组织分布和亚细胞定位;3.研究在293T细胞中,过表达LSDP5,脂滴的变化。【方法】1.利用PCR方法克隆LSDP5全长基因;2.构建GST融合表达质粒pGEX-LSDP5,在大肠杆菌BL21中进行诱导表达,经GST融合蛋白纯化系统纯化。纯化的蛋白用于免疫新西兰大白兔,制备多克隆抗体;3.提取小鼠组织蛋白,利用Western Blot和LSDP5多克隆抗体,确定LSDP5的组织分布。4.构建真核表达质粒pCMV5-HA-LSDP5,通过脂质体转染,利用Bodipy 493/503进行脂滴染色,经荧光显微镜检测,研究LSDP5的亚细胞定位和过表达LSDP5后脂滴的变化;5.通过Western blot检测细胞中LSDP5蛋白的表达水平。【结果】1.利用LSDP5特异性引物从小鼠肝脏的cDNA文库中克隆了LSDP5基因,经测序,与Genebank公布的一致。通过疏水性和二级结构分析,将LSDP5的片段克隆到原核表达载体pGEX-4T-1,构建GST融合表达质粒pGEX-LSDP5,在大肠杆菌BL21中进行诱导表达,经GST融合蛋白纯化系统纯化,纯化的蛋白经SDS-PAGE和凝胶薄层扫描,纯度大于90%。纯化的蛋白用于免疫新西兰大白兔,制备多克隆抗体。2.提取小鼠肝脏、肾脏、脾脏、肺、心肌、脑组织、肌肉组织、小肠、胰腺等组织蛋白,利用Western Blot和LSDP5多克隆抗体,确定LSDP5的组织分布。同时,还构建了LSDP5与凝血素(Hemagglutinin,HA)基因融合表达质粒pCMV5-HA-LSDP5。通过转染COS7细胞,利用Bodipy 493/503进行脂滴染色,经荧光显微镜检测,我们发现LSDP5定位于脂滴表面。通过转染293T细胞,发现其脂滴大小和数量明显增加。【结论】本研究从小鼠肝脏cDNA文库中克隆了LSDP5全长基因,并在COS7细胞中确定了其亚细胞定位。成功地构建了原核表达载体,获得了较纯(90%)的LSDP5融合蛋白以及LSDP5蛋白的兔多克隆抗体。通过抗体制备,全面检测了LSDP5的组织分布。在293T细胞中,过表达LSDP5,脂滴大小和数量明显增加。本研究为研究LSDP5在脂肪代谢过程中的作用及其机制提供了研究基础。