论文部分内容阅读
研究目的：人免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus, HIV)与猴免疫缺陷病毒(Simian immunodeficiency virus, SIV)具有亲缘关系，均属于逆转录病毒科慢病毒属。SIV/恒河猴动物模型被广泛应用于AIDS的研究中。HIV p24蛋白是核衣壳蛋白，也是病毒的主要抗原成分,常用于病毒的定性定量检测。对应在SIV的p27蛋白，也常用于动物或体外细胞中检测SIV的感染。本文旨在利用基因工程的方法获得高纯度的p27抗原，制备抗p27单克隆抗体，用于检测细胞和组织中SIV感染情况。研究方法：从SIVmac251基因组提取RNA，以随机引物进行逆转录反应，合成cDNA。PCR按照常规方法进行。根据GenBank中猴免疫缺陷病毒SIV全基因组序列的p27蛋白的基因序列(M19499.1)合成引物：正向引物5’-GGA TCC ATG CCG AGA ACA TTA AAT GGG-3’，反向引物5’-GTC GAC TGC CAT TAA TCT AGCCTT CTG-3’。回收PCR产物，克隆至pMD18-T载体，筛选阳性克隆送测序。提取pMD18-p27和pET-23a质粒分别用BamHⅠ和SalⅠ双酶切，琼脂糖凝胶电泳回收目的片段，将目的基因和载体连接，构建pET-p27质粒，转化大肠杆菌DH5α，菌落PCR鉴定阳性克隆,抽提质粒DNA,用BamH I和Sal I双酶切进一步鉴定并转化大肠杆菌BL21(DE3)plysS。接种含重组表达质粒的大肠杆菌BL21(DE3)plysS于培养基中培养诱导,分析目的蛋白的表达状况。利用亲和层析技术纯化目的蛋白，免疫印迹检测其活性。用纯化后的p27蛋白免疫小鼠。获取其脾细胞，在PEG作用下与骨髓瘤细胞SP2/0融合。经过选择性培养后，筛选产生p27单抗的杂交瘤细胞株，间接ELISA法测定McAb的效价。利用免疫组化技术、流式细胞术分别检测经SIVmac251感染后CEM×174细胞内的病毒抗原。研究结果：成功表达并纯化了p27蛋白。获得6株稳定分泌抗SIV p27单克隆抗体杂交瘤细胞株。能识别感染SIV的猴子血清中的病毒。其中2株能用于免疫组化实验，1株用于细胞内染色流式分析。研究结论：成功克隆猴免疫缺陷病毒p27基因，构建原核表达载体pET-p27，在大肠杆菌BL21(DE3)plysS中高效表达出p27蛋白。成功制备了抗SIV p27蛋白的单克隆抗体，为后期检测感染SIV的动物实验奠定基础。