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迟缓爱德华氏菌（Edwardsiella tarda,E.tarda）是一种肠杆菌科革兰氏阴性短杆菌,该菌具有广泛的宿主范围,可以引起鱼类、两栖类、爬行类、哺乳类动物的疾病,给水产养殖业带来极大的危害。E.tarda是一种兼性胞内寄生菌,它的溶血相关基因（简称eha）是该菌的一个重要转录调控基因,而色氨酸酶（TnaA）能够催化色氨酸产生吲哚,吲哚具有细菌密度感应信号的特征,它能够参与调控细菌的各种生理活动。本课题旨在研究tnaA以及转录调控因子Eha调控tnaA影响细菌在巨噬细胞内的存活及毒力机制。本课题组前期通过ChIP实验发现Eha能够与tnaA高度结合,本研究首先通过qRT-PCR检测ET13野生株及△eha中tna A基因的表达差异,结果表明,eha影响tnaA的转录表达;构建tnaA基因启动子区和lacZ融合表达重组质粒pBAD-lacZ-PtnaA,并用电击法将其分别导入ET13野生株与△eha株中,得到pBAD-lac Z-PtnaA-ET13株和pBAD-lacZ-PtnaA-△eha株;检测上述两菌株在pH=6.3和0.10%H2O2条件下的β-半乳糖苷酶活性差异,结果表明,eha可以直接调控tnaA的转录。其次,本研究利用自杀质粒pHM5构建ET13野生株的tnaA缺失株（△tnaA）和tnaA互补株（ComptnaA）,并在ET13野生株的eha缺失株（△eha）中过表达tnaA基因的△eha-tnaA株。通过二甲氨基苯甲醛光度法分别检测野生型ET13、ComptnaA、△eha-tnaA和△tnaA菌株生长过程中产生吲哚的浓度,结果显示,当细菌生长到3-12h时,tnaA缺失影响ET13野生株的吲哚产量。分别将上述四种菌株感染RAW264.7细胞,比较它们在巨噬细胞内的存活能力,结果表明tnaA可以促进ET13野生株在巨噬细胞内的生存和繁殖,pACYC184-tnaA质粒可部分回复△eha在巨噬细胞内下降的胞内存活能力。为进一步探究tnaA及Eha调控tnaA影响细菌的胞内存活机制,体外模拟巨噬细胞胞内存活环境,检测上述细菌在酸性条件下的存活率及其对过氧化氢的敏感性。实验结果表明,tnaA缺失能够抑制E.tarda菌在酸性环境下的存活,并提高该菌对过氧化氢的敏感性;进一步通过巴弗洛霉素抑制巨噬细胞酸化实验结果表明,巨噬细胞的酸化抑制上述菌株在巨噬细胞内的繁殖,同时tnaA基因在调控E.tarda抵御巨噬细胞酸化中起了重要作用。同时,检测上述菌株感染巨噬细胞后细胞产生活性氧的差异,实验结果表明,tnaA缺失使巨噬细胞产生活性氧的水平增高,同pACYC184-tnaA质粒可部分回复△eha在巨噬细胞内抵抗活性氧的能力;通过Western blot检测上述菌株感染巨噬细胞后,对巨噬细胞自噬的影响,结果发现,E.tarda能够诱发巨噬细胞的自噬,但是tnaA没有影响该菌诱发巨噬细胞自噬的能力。最后,腹腔注射E.tarda菌感染小鼠,检测ET13野生株与△tnaA在小鼠体内的存活实验,结果显示,△tnaA可以入侵小鼠的肝脏、脾脏、肾脏和肺脏,但是与ET13野生株相比,△tnaA在这些脏器分布的细菌数目明显较低。比较ET13野生株和△tnaA对小鼠和斑马鱼的半数致死量(LD50)差异,结果显示,在小鼠中,△tnaA的LD50比ET13野生株低3.62倍,在斑马鱼中低14.36倍,同时,用ET13野生株注射斑马鱼的LD50比注射小鼠的LD50约低1.6×103倍,说明只需要注射较低剂量的细菌数目就可以对斑马鱼产生半数致死量,所以斑马鱼作为E.tarda的感染宿主更敏感。以上研究结果表明,tnaA或Eha调控tnaA,有利于E.tarda抵御巨噬细胞内杀菌的环境如活性氧和高度酸化等,增强了细菌的毒力。本研究为深入研究该菌的致病机制及网络调控系统提供了重要依据。