论文部分内容阅读
[背景与目的]内皮功能紊乱是动脉粥样硬化发生发展机制中的重要始动环节,氧化低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein ox-LDL)可以导致血管内皮损伤、血管壁炎症并加速动脉粥样硬化病变。HDL-S1P的血管内皮保护效应主要是通过S1P与不同亚型的G蛋白偶联受体结合所产生不同的生物学效应。已有研究证明S1PR2在内皮细胞中是致动脉粥样硬化的作用,但是与高密度脂蛋白结合的S1PR2最终没有表现出致动脉粥样硬化的作用。HDL高亲和受体SR-BⅠ和HDL-S1P通过共同的细胞内信号通路SR-BⅠ-PI3K-AKT抑制NF-κB的核转位和炎症因子的表达。故提出假设:可能是高密度脂蛋白结合的S1PR2对血管内皮炎症的影响和强度部分或主要依赖于SR-BⅠ。[方法]1.培养人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells HUVEC),选择不同浓度和不同时间的ox-LDL进行处理后,采用Western Blot检测S1PR2的蛋白表达水平。2.培养人脐静脉内皮细胞,选择不同浓度的S1P进行处理24h后,采用Western Blot检测炎症因子TNF-α、IL-1β的蛋白表达水平,人Elisa试剂盒检测细胞培养液中TNF-α、IL-1β和IL-10的含量。3.以ox-LDL60μg/ml的浓度处理培养的人脐静脉内皮细胞6h后,分别用S1P(1μM),S1P(1μM)和VPC23019(S1PR1/3抑制剂,10μM),S1P(1μM)和JTE-013(S1PR2抑制剂,10μM)处理24 h,采用Western Blot检测炎症因子TNF-α、IL-1β的蛋白表达水平,人Elisa试剂盒检测细胞培养液中TNF-α、IL-1β和IL-10的含量。4.以ox-LDL60μg/ml的浓度处理培养的人脐静脉内皮细胞6h后,分别以S1P(1μM),apo A-1(30μg/ml),apo A-1(30μg/ml)+BLT-1(10μM)以及ox-LDL60μg/ml的浓度处理转染了SR-BⅠ到人脐静脉内皮细胞24h后,用apo A-1(30μg/ml)处理24h后,采用Western Blot检测SR-BⅠ,炎症因子TNF-α、IL-1β的蛋白表达水平,人Elisa试剂盒检测细胞培养液中TNF-α、IL-1β和IL-10的含量。5.以ox-LDL60μg/ml的浓度处理培养的人脐静脉内皮细胞6h后,加入S1P(1μM)处理,再分别加入apo A-1(30μg/ml),apo A-1(30μg/ml)+LY294002(10μM)(PI3K抑制剂),apo A-1(30μg/ml)+MK2206(1μM)(Akt抑制剂),L-NAME(50μmol/L)(e NOS抑制剂)处理24 h后,采用Western Blot检测PI3K,AKT的磷酸化水平;e NOS试剂盒检测NOS的活性;免疫荧光检测NF-κB的核转位。[结果]1.60μg/ml ox-LDL处理人脐静脉内皮细胞6h,S1PR2的蛋白表达水平达到最高。2.1μΜS1P处理人脐静脉内皮细胞24h后,炎症因子TNFα、IL-1β的蛋白的表达水平及培养液中水平达到最高。3.与ox-LDL60μg/ml处理培养的人脐静脉内皮细胞组相比较,S1P(1μM)组和S1P(1μM)和VPC23019(S1PR1/3抑制剂,10μM)组炎症因子TNF-α、IL-1β的蛋白的表达水平及培养液中水平显著提高。4.与ox-LDL60μg/ml处理培养的人脐静脉内皮细胞组相比较,S1P(1μM)组和apo A-1(30μg/ml)+BLT-1(10μM)组炎症因子TNF-α、IL-1β的蛋白的表达水平及培养液中水平显著提高。5.ox-LDL60μg/ml的浓度处理培养的人脐静脉内皮细胞6h,与S1P(1μM)+apo A-1(30μg/ml)组相比较,S1P(1μM)+apo A-1(30μg/ml)+LY294002(10μM)(PI3K抑制剂),S1P(1μM)+apo A-1(30μg/ml)+MK2206(1μM)(Akt抑制剂),S1P(1μM)+L-NAME(50μmol/L)组免疫荧光检测NF-κB的核转位水平显著降低。[结论]1.S1P对内皮细胞的炎症效应主要是通过S1PR2。2.SR-BⅠ抑制S1P/S1PR2对血管内皮细胞的炎症效应。3.SR-BⅠ抑制S1P/S1PR2对血管内皮细胞的炎症效应与PI3K–AKT-e NOS信号通路有关。