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背景&目的肠粘膜屏障由粘液和粘液下上皮细胞所组成,由上皮细胞合成或分泌的黏蛋白主要由O-型糖链组成。因此黏蛋白分子的功能与其上的O-型糖链密切相关。同时有文献报道,肠道黏蛋白O-型糖链可作为某些细菌的粘附位点;黏蛋白O-型糖链与一些肿瘤的侵袭转移及预后相关。但是结肠上皮细胞中黏蛋白O-型糖基化修饰与肠道致病菌(EPEC和EHEC O157:H7)之间的相互作用,以及刺激信号转导进而调控肿瘤转移的具体机制仍不完全清楚。O-型糖链的合成始于GalNAc或甘露糖转移到多肽丝氨酸,苏氨酸和脯氨酸残基上,首先形成Tn(GalNAca1-Ser/Thr)抗原,糖链的延伸是在Tn抗原的基础上,由各种糖基转移酶催化完成,其核心结构主要有八种(Core1-8)。因此,我们通过benzyl-α-GalNAc抑制O-型糖链合成来探讨O-型糖链对肠道致病菌粘附和侵袭肠上皮细胞的影响;通过干扰Core 2 O-型糖链合成来探讨Core 2 O-型糖链对细菌粘附和侵袭肠上皮细胞的影响;通过再表达Core 3合酶来探讨Core 3 O-型糖链调节结肠上皮细胞EMT-MET可塑性的分子机制。肠上皮细胞的更新与分化是肠上皮粘膜屏障的主要机制之一,Ascl2所调节的肠隐窝干细胞更新是维持肠上皮粘膜的重要来源。文献报道,在Lgr5+的隐窝干细胞存在自转录激活现象,本研究探讨Ascl2在结肠癌前体细胞内是否存在该现象及其生物学意义。因此,我们通过流式细胞仪分选出CD133-CD44-和CD133+CD44+结肠癌细胞,通过不同浓度Wnt/R-spondin1刺激来探讨Ascl2自调控的分子机制。方法1.黏蛋白Core 2 O-型糖链调节细菌粘附和侵袭肠上皮细胞的研究1.1 HT-29-Gal细胞模型的建立。1.2 benzyl-α-GalNAc抑制结肠上皮细胞O-型糖链合成,得到HT-29-OBN和HT-29-Gal-OBN细胞。1.3通过lectin(Con A,GSL-II,MAA,PNA,DBA,UEA-I)染色,明确建立的细胞模型是否发生糖基化改变。1.4 EPEC或EHEC O157:H7粘附和侵袭结肠上皮细胞通过直接染色、平板克隆计数、GFP标记细菌观察。1.5通过干扰Core 2 O-型糖链的合成,观察O-型糖链对EPEC或EHEC O157:H7粘附或侵袭结肠上皮的影响。1.6在EPEC或EHEC O157:H7感染下,通过TEER测定和免疫荧光染色紧密连接蛋白,明确细菌对细胞屏障的影响。2.黏蛋白Core 3 O-型糖链调节结肠癌MET的研究2.1通过分析TCGA数据库和GEO数据库,明确Core 3合酶在肿瘤组织与正常组织表达差异,以及临床意义(淋巴转移、远处转移和预后)。2.2 Core 3合酶再表达细胞株的构建;并检测Core 3合酶再表达后,细胞增殖、迁移、侵袭、成瘤能力的改变;以及EMT相关标志物的改变。2.3 Core 3合酶再表达是否影响O-型糖链的结构、MUC1糖基化、MUC1-C核转位及p53和mi R-200c的表达。2.4通过构建p53和mi R-200c启动子的萤光素酶报告质粒分别转染对照细胞和Core 3合酶再表达细胞,明确Core 3 O-型糖链对p53和mi R-200c基因转录的影响。并通过Ch IP实验证实MUC1-C与p53启动子,p53与mi R-200c启动子存在直接结合。2.5通过MUC1-C核转位抑制剂(GO201)、干扰MUC1或p53、mi R-200c抑制剂,进一步明确Core 3 O-型糖链是通过MUC1-C/p53/mi R-200c轴调节结肠上皮细胞EMT-MET可塑性。3.Ascl2自调控的研究3.1通过PCR和Western blot验证外源性Ascl2是否激活内源性Ascl2的表达。3.2通过Ch IP和双荧光素酶实验明确Ascl2是否通过直接自调控环激活内源Ascl2的表达。包括Ascl2结合到自身启动子,并转录激活Ascl2基因的表达。3.3流式细胞仪分选出结肠上皮细胞中CD133-CD44-CRC和CD133+CD44+CRC细胞群。3.4不同浓度R-spondin1/Wnt刺激CD133-CD44-CRC和CD133+CD44+CRC细胞群,并通过PCR和Western blot检测Ascl2的表达,通过双荧光素酶实验检测Ascl2荧光素酶活性变化。结果1.黏蛋白Core 2 O-型糖链调节细菌粘附和侵袭肠上皮细胞的研究1.1 benzyl-α-GalNAc处理HT-29细胞及分化的HT-29-Gal细胞导致O-型糖基化的改变。1.2 lectin组织化学染色证实在HT-29-Gal-OBN和C2Gn T2-sh2/HT-29细胞中PNA(特异性识别Galβ1,3GalNAc)的染色明显强于其对照细胞。1.3抑制结肠上皮细胞O-型糖链的合成将导致EPEC和EHEC O157:H7粘附减少;抑制结肠上皮细胞Core 2 O-型糖链合成将导致EPEC和EHEC O157:H7粘附明显减少。1.4通过共聚焦观察发现GFP标记的EPEC和EHEC O157:H7侵袭入HT-29及其分化细胞中;侵袭入促分化HT-29细胞(HT-29-Gal)中的EPEC明显少于其对照HT-29细胞(P<0.01);抑制HT-29细胞或HT-29-Gal细胞中O-型糖链的合成导致细菌侵袭易感(P<0.05和P<0.01);EPEC和EHEC O157:H7侵袭入Core 2 O-型糖链缺失的HT-29细胞中的细菌数较对照细胞明显增加(P<0.05)。1.5抑制结肠上皮细胞O-型糖链的合成导致MUC2表达明显减少,但抑制结肠上皮细胞Core 2 O-型糖链的合成对MUC2的表达没有明显影响;同时在EPEC或EHEC O157:H7感染下,occludin蛋白在细胞膜的分布呈现不连续,颗粒样聚集。2.黏蛋白Core 3 O-型糖链调节结肠癌MET的研究2.1 Core 3合酶表达下调导致结直肠癌病人预后差,并与淋巴结转移和远处转移密切相关。2.2 Core 3合酶再表达抑制结肠上皮细胞增殖、迁移、侵袭和成瘤能力。2.3黏蛋白Core 3 O-型糖链合成于结肠癌细胞膜表面的MUC1-N端,可通过修饰MUC1-N端,进而导致MUC1-C端核转位抑制,并启动p53基因的转录和激活p53调控的mi R-200c的表达,导致细胞出现间质向上皮转化(MET)过程的发生。2.4通过si RNA和mi R-200c抑制剂抑制MUC1,p53或mi R-200c的表达,抑制MUC1的表达导致EMT的进一步的加强,抑制p53或mi R-200c逆转Core 3合酶过表达结肠癌细胞株的MET进程。2.5在结肠癌组织样本中,Core 3合酶的m RNA表达与p53和mi R-200c的表达呈显著正相关。3.Ascl2自调控的研究3.1外源Ascl2可通过直接自调控环激活内源Ascl2的表达。包括Ascl2结合到自身启动子,并转录激活Ascl2的表达。3.2在结肠癌组织中,Ascl2表达量明显高于其对应的癌旁组织,且结合自身启动子的量也明显高于其对应的癌旁组织。3.3 Ascl2自调控主要发生在CD133+CD44+CRC细胞群。在CD133+CD44+CRC细胞群中,R-spondin1/Wnt呈剂量依赖性激活Ascl2表达。该现象不出现在CD133-CD44-CRC细胞群。3.4 R-spondin1/Wnt处理的CD133+CD44+和CRC CD133-CD44-CRC细胞“干性”维持模式不同。R-spondin1/Wnt导致CD133+CD44+CRC细胞剂量依赖性的干性维持。结论1.黏蛋白Core 2 O-型糖链调节肠道致病菌(EPEC和EHEC O157:H7)粘附结肠上皮细胞。2.黏蛋白Core 2 O-型糖链调节肠道致病菌(EPEC和EHEC O157:H7)侵袭结肠上皮细胞。3.黏蛋白Core 3 O-型糖链的恢复触发结肠上皮细胞MUC1/p53/mi R-200c依赖的上皮特性。4.R-Spondin1/Wnt增强的Ascl2自调控维持结肠癌前体细胞的自更新。