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背景与目的 缺血性脑卒中(cerebral ischemic stroke)又名脑梗死(cerebral infraction),指急性起病,多种病因导致大脑血液供应发生障碍,使相对应的脑组织发生缺血缺氧坏死,从而引起相应部位的神经谱系细胞死亡,最终导致相对供血区的神经功能障碍。由于缺血性脑卒中存在发病率高、致残率高及死亡率高等情况,目前它已成为我国首位致死病因,从而给社会带来了沉重的负担,因此寻找行之有效的治疗脑梗死方法显得尤为重要。尽管应用溶栓药物可以改善疾病的预后,但由于其存在出血的风险和治疗时间窗的狭窄性,使得绝大多数脑梗死患者无法得到有效的救治。目前,全能/多潜能外源性干细胞移植是针对缺血性脑卒中最有潜能的治疗方针。骨髓单个核细胞(Bone marrow mononuclear cells,BMMNCs)是由多种成分的混合细胞群构成的,包括骨髓间充质干细胞(Mesenchymestemcells,MSCs)、内皮祖细胞(endothelialpregenitor cells,Ep Cs)及造血干/祖细胞(hematopoieticstem cell,HSCs)等。由于BMMNCs可以自体移植、取材方便、无伦理道德争议等优点,使其受到广泛的关注。对缺血性卒中模型研究发现,静脉移植的BMMNCs不仅可以通过血脑屏障(blood brain barrier,BBB)并能够分化为神经谱系细胞。诸多研究表明移植BMMNCs治疗缺血性脑卒中模型可以有效减小脑梗死体积,促进神经功能的恢复,然而移植BMMNCs的疗效及其产生的可能性机制仍不清楚。基质细胞衍生因子-1(stromal cell derived factor 1,SDF-1)是作为α组趋化因子家族成员之一,可表达于骨骼肌、骨髓、心脏和大脑等多个组织器官。当脑组织缺血缺氧时,SDF-1表达上调,可以招募表达CXCR4受体的干细胞到缺血部位。而CXCR4作为SFD-1特异性受体,也广泛表达在MSCs、Ep Cs和HSCs等的表面。在对大鼠脑缺血模型的研究发现,SDF-1/CXCR4通路可以招募骨髓MSCs至缺血的脑组织。AMD3100作为SDF-1的特异性拮抗剂,也可抑制SDF-1诱导的MSCs的迁移。研究报告,骨髓MSCs可以产生细胞因子作用于相关细胞,甚至促进受损组织的再生,促进内源性细胞的增殖,调节宿主的炎症和免疫反应。由于BMMNCs也表达CXCR4受体,由此可以推断SDF-1/CXCR4通路在BMNNCs治疗缺血性脑卒中时也起着重要的作用。为了探索BMMNCs的神经保护机制,本研究以脑梗死小鼠为实验模型,评估BMMNCs移植的安全性,调查SDF-1/CXCR4通路是否在BMMNCs迁移过程中发挥作用,进一步测定移植BMMNCs后脑梗死小鼠脑内炎症、营养因子的水平以及行为学功能的改变。第一部分骨髓单个核细胞成瘤性目的：将BMMNCs细胞接种到裸鼠体内,通过观察其是否具有成瘤性评估其应用的安全性。方法: 增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)小鼠12只,体质量18-22g。裸小鼠24只,体质量18-22g。应用随机化原则将裸小鼠分为HL-60组、BMMNCs移植组(BMMNCs)。分别将HL-60细胞和EGFP小鼠的BMMNCs接种至各组裸鼠皮下,并观察到裸鼠生活状态,精神、饮食、排便情况。接种BMMNCs60d后,观察裸鼠一般状态及接种部位。结果： 将BMMNCs接种裸鼠皮下后,观察到裸鼠生活状态良好,饮食、精神、排便均无异常;接种BMMNCs60d后,发现BMMNCs组裸鼠状态仍然良好,且接种部位未见明显的肿块形成。接种HL-60后,裸鼠精神状态较差,逐渐出现恶病质,接种BMMNCs60d后,接种部位形成明显的肿块。结论：移植BMMNCs至裸鼠体内不具有成瘤性,可以安全应用与实验研究。第二部分SDF1/CXCR4通路对骨髓单个核细胞在脑梗死小鼠脑内的迁移分化的影响目的：将BMMNCs细胞和AMD3100干预的BMMNCs分别移植给脑梗死小鼠,观察移植BMMNCs在脑梗死小鼠脑内的迁移及分化情况,评估SDF-1/CXCR4通路对BMMNCs移植脑梗死小鼠体内迁移分化的影响。方法： 雄性EGFP小鼠72只,体质量18-22g。雄性C57/BL6小鼠72只,体质量18-22g。应用随机化原则将C57/BL6小鼠分为溶剂组(Vehicle)、BMMNCs移植组(BMMNCs)和AMD3100移植组(AMD3100)。应用线栓法来制作小鼠大脑中动脉脑梗死模型(p MCAO)。通过密度梯度法获取EGFP小鼠BMMNCs,BMMNCs组和AMD3100组于脑梗死24h后分别经尾静脉注入200μL含5×106个BMMNCs和5×106个预先被AMD3100干预的BMMNCs细胞悬液,Vehicle组注射同等体积PBS溶液。于移植后7、14、28和35天观察移植细胞情况。结果: 在细胞移植7d时,BMMNCs组移植的BMMNCs进入脑梗死组织,数目明显高于AMD3100组移植的BMMNCs。免疫荧光双染结果显示BMMNCs组大量BMMNCs迁移至脑梗死区域,并且极少数GFAP细胞以及IBA1细胞同时共表现出EGFP免疫阳性,而Neun细胞未能表现出EGFP免疫阳性,提示BMMNCs可在脑梗死区域分化为星形胶质细胞及小胶质细胞,但未能分化为神经元。结论: BMMNCs可能是通过SDF-1/CXCR4通路迁移至脑梗死侧,并且在受损区域分化为小胶质细胞和星形胶质细胞,这可能是移植的BMMNCs发挥神经保护作用的机制之一。第三部分SDF1/CXCR4通路对骨髓单个核细胞移植脑梗死小鼠体内因子变化的影响目的： 研究移植BMMNCs细胞和AMD3100干预的BMMNCs对脑梗死小鼠脑内炎症因子与营养因子的影响,评估SDF-1/CXCR4通路对BMMNCs移植脑梗死小鼠的神经保护作用。方法： 雄性EGFP小鼠48只,体质量18-22g。雄性C57/BL6小鼠48只,体质量18-22g。应用随机化原则将实验动物分为假手术组(Sham-operated)、溶剂组(Vehicle)、BMMNCs移植组(BMMNCs)和AMD3100移植组(AMD3100)。细胞移植及模型制作方法同第二部分。于细胞移植后3天应用Western blot方法检测脑部炎症因子TNF-α、IL-1β和营养因子BNDF、GDNF的表达情况。结果： Western blot定量检测结果显示,细胞移植3天后,BMMNCs组脑组织中的TNF-α、IL-1β水平明显低于AMD3100组和Vehicle组(P<0.05),且AMD3100组和Vehicle的TNF-α、IL-1β水平差别无统计学意义(P>0.05)。BMMNCs组脑组织中的BNDF和GDNF蛋白表达水平明显高于AMD3100组(P<0.05),而AMD3100组和Vehicle组的BNDF和GDNF水平差别无统计学意义(P>0.05)。结论：BMMNCs可能是通过SDF1/CXCR4通路并在在蛋白水平抑制炎症因子的表达、同时促进营养因子的表达,这可能是修复受损脑组织、产生疗效的机制之一。第四部分SDF-1/CXCR4通路对骨髓单个核细胞移植脑梗死小鼠脑梗死体积及神经功能的影响目的： 探讨SDF-1/CXCR4通路对BMMNCs移植脑梗死小鼠的神经功能及脑梗死体积的影响,评价BMMNCs对脑梗死小鼠的治疗价值。方法： 雄性EGFP小鼠72只,体质量18-22g。雄性C57/BL6小鼠72只,体质量18-22g。细胞移植及模型制作方法同第三部分。于细胞移植后后1、7、14、21、28和35天采用神经功能损害严重程度评分(m Nss)观察神经行为学功能,于移植BMMNCs后7天采用TTC染色法评估小鼠脑梗死体积的改变。结果： BMMNCs组的m NSS评分均明显低于vehicle组和AMD3100组,差异具有统计学意义(P<0.05)。移植后1天,BMMNCs组、AMD3100组和vehicle组组间比较显示组间差异不具有统计学差异(P>0.05),而移植后7天、14天、21天、28天和35天各组间差异均有统计学意义(P<0.05)。TTC染色结果显示BMMNCs组小鼠脑梗死总体积明显小于Vehicle组和AMD3100组,其结果具有统计学差异(P<0.01)。结论： BMMNCs能够显著的促进脑梗死小鼠神经功能的恢复,并明显的减少脑梗死体积,这可作为BMMNCs产生神经保护功能机制之一。