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由于学习期间获得国家留学基金委的资助,博士论文的相关研究分别在中国农业科学院农业资源与农业区划研究所和佛罗里达大学微生物学和细胞生物学系进行,故研究内容分为两个部分。第一部分:两种侧耳高温胁迫导致的细胞凋亡研究。我国食用菌产业经过30多年高速发展,在种植业中,成为位居粮、菜、果、油之后的第五大作物,2013年产量已超过3100万吨、产值超过1700亿元。其中平菇产量位居第二,超过总产的18%,而糙皮侧耳和肺形侧耳是平菇的主要栽培种。但长期以来我国平菇的生产大多采用农业方式的粗放栽培,受自然环境条件影响较大。特别是在生长中常遭遇到高温天气。高温(>38oC)是影响食用菌生长发育的重要环境因子,但高温胁迫下相关响应机制的研究报道很少。为了探究食用菌发菌期高温的危害机理,以侧耳属(Pleurotus)的两个主要栽培栽培种P.ostreatus和P.pulmonarius的两个生产品种CCMSSC00358(特白一号)和CCMSSC00493(凤尾菇)为实验材料,在高温胁迫下(42℃,0.5h-4h),检测了细胞核浓缩情况,细胞活性氧水平和染色体DNA的片段化,以探讨菌丝细胞凋亡的发生情况。结果表明:在高温胁迫下,供试材料CCMSSC00358和CCMSSC00493菌丝均发生了细胞凋亡的现象,但是,二者细胞凋亡发生的时间和程度具一定差异。其中CCMSSC00358菌丝在42℃胁迫3.5h后,核浓缩比例达到最高的53.8%,活性氧比例为32.4%,片段化比例为32.6%。CCMSSC00493菌丝在42℃胁迫2h后,核浓缩比例最高的53.6%,活性氧为38.4%,片段化比例为24.5%。为了进一步探究高温胁迫下细胞凋亡发生的依赖途径,分别将外源抑制剂寡霉素和NAC添加到菌丝中,经高温处理后发现核浓缩、活性氧和DNA片段化的比例均有显著下降。结果表明,在高温胁迫下,CCMSSC00358和CCMSSC00493菌丝均发生了细胞凋亡的现象,其细胞凋亡的依赖途径为线粒体依赖途径和活性氧依赖途径。第二部分:球孢白僵菌胁迫响应转录机制的研究在国家留学基金委的资助下,2013年9月-2015年3月,在美国佛罗里达大学从事球孢白僵菌(Beauveriabassiana)胁迫响应相关的转录因子Bb MSN2(Stress Response Element Binding Protein)与启动子相互作用及转录因子Bb TBP(TATA-Binding Protein)与转录辅因子Bb MBF1(Multiprotein Bridging Factor)相互作用的研究。球孢白僵菌和食用菌同为丝状真菌,其环境胁迫的研究思路和研究方法对食用菌高温胁迫的研究工作有很好的借鉴作用。球孢白僵菌是一种广谱性杀虫真菌,其分生孢子可以附着于昆虫的表皮,通过机械压力或体壁降解酶类穿透昆虫体壁,菌丝在虫体内生长并致病昆虫。目前球孢白僵菌已广泛用于节肢动物的生物防治。其在生长发育,环境胁迫响应以及昆虫侵染机制的研究方面取得了诸多进展。也逐渐发展为丝状真菌研究的模式物种。转录因子MSN2/4可以识别启动子区域含有胁迫响应基序(Stress Responsive Element,STRE)AGGGG/CCCCT的位点,调节高温胁迫等相关基因的表达。为了验证球孢白僵菌转录因子Bb MSN2是否也具有识别AGGGG/CCCCT核心序列的能力,大肠杆菌外源表达球孢白僵菌的Bb MSN2蛋白后,合成了3个包括不同数量核心序列的探针和多个核心序列点突变探针,将Bb MSN2蛋白和探针结合,应用凝胶迁移实验(EMSA)的方法,检测探针的迁移情况。结果表明,含有核心序列的探针均发生了凝胶迁移现象,Bb MSN2可以和含有核心序列探针结合,相比未突变的探针,点突变的探针与Bb MSN2的结合能力发生了显著的降低。这也说明Bb MSN2对AGGGG/CCCCT序列的识别具有很强的特异性。另外,Bb MSN2蛋白和球孢白僵菌毒力和生长相关基因启动子的凝胶迁移实验表明,Bb MSN2蛋白可以和蛋白酶基因(SSP和CDEP-1)及几丁质酶基因(Chitinase,CHIT1)的启动子结合,但Bb MSN2与启动子相互作用的的亲和力较弱,KD值约为0.39μM。同时,分别用含有AGGGG/CCCCT序列和点突变核心序列的探针对Bb MSN2和CDEP-1启动子结合体系进行竞争性实验(Competition Assay),结果也表明,Bb MSN2对AGGGG/CCCCT序列的识别具有特异性,同时不同的点突变序列对蛋白和核酸结合体系竞争效果有差异。MBF1是转录辅激活因子,多项研究表明它能与其他辅助因子一起桥连通用转录因子TBP与靶基因启动子上游的保守序列TATA-box特异结合,调控或激活靶基因转录。但在丝状真菌中TBP和MBF1相互作用及TBP与TATA-box相互作用的研究很少。为了探究球孢白僵菌中Bb TBP与TATA-box的相互作用,将Bb TBP蛋白和合成的TATA-box核心序列探针结合,应用凝胶迁移实验方法,检测Bb TBP与TATA-box体外的相互作用,结果表明:Bb TBP可以和TATA-box核心序列探针相互作用,且Bb TBP与TATA-box核心序列的亲和力很强,KD值为1.2 n M。为了探究BbMBF1与BbTBP蛋白间相互作用,将Bb MBF1、Bb TBP和TATA-box核心序列的探针一起混合,通过凝胶迁移实验检测探针的迁移情况。结果表明,Bb MBF1存在的情况下,含有TATA-box核心序列的探针发生了凝胶的Super-shift现象。另外,我们尝试了一种基于电化学阻抗谱(Electrochemical Impedance Spectroscopy,EIS)方法建立的生物传感器,对Bb TBP和TATA-box相互作用及Bb TBP与Bb MBF1的相互作用进行了阻抗分析。测试的结果和凝胶迁移实验结果一致。以上结果表明:1.Bb TBP可以和含有TATA-box核心序列探针结合;2.Bb MBF1可以和Bb TBP发生相互作用;3.Bb MBF1不能直接和TATA-box核心序列探针结合;4.Bb TBP可能调控Bb MBF1与TATA-box核心序列的相互作用。