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心血管疾病(Cardiovasculardisease,CVD)是一类涉及心脏和血管的疾病的总称,其中以冠状动脉粥样硬化性心脏病(Coronary artery disease,CAD)最为常见。CAD是以运动后或劳累后胸痛或胸部不适伴有肩、背、下颌放射痛和气短无力为典型临床表现的心肌血供受阻的致死性疾病。斑块栓塞及斑块破裂导致的冠状动脉慢性和急性阻塞是心肌供血受阻的直接原因和解剖学基础。动脉粥样硬化(Atherosclerosis,AS)是冠状动脉内斑块发生和发展的组织学基础,也是CAD的病理基础和主要原因。CAD是一种全年龄疾病,但常见于老年人及中年人。CAD的高发病率和高致死率使其与癌症、脑血管疾病一起并列成为21世纪人类的三大杀手。由于其好发于物质充足社会,因此随着发展中国家经济的广泛发展和老龄化的逐渐到来,占世界一半之一以上的新兴国家的人口正面临CAD的威胁,其中以中国社会情况尤为严峻。在中国,CAD正成为中国人群的主要死因,其带来的社会经济负担更为严重。AS的发生原因和机制非常复杂,尚未完全探明,但多种学说共同指出巨噬细胞在其病理生理学机制中扮演中心角色。在体内脂质增多和炎症反应等因素共同作用下,微环境发生紊乱导致单核细胞潜入动脉血管内皮下分化为巨噬细胞并摄取变性脂质,最终成为泡沫细胞。泡沫细胞诱导产生各种炎症介质,通过包括免疫学途径在内的各种生物信号通路吸引更多的单核细胞趋向性聚集,形成炎症瀑布效应,使血管内皮下形成脂质池,导致动脉内斑块产生。既往学说认为不良生活习惯、高血压糖尿病等基础疾病和高脂饮食是导致AS发生发展的主要因素。但近来发现显示AS和CAD表现出很强的家族聚集性及遗传特性。现在AS和CAD被认为是一种多种基因在环境因素作用下共同调控的多基因疾病。尽管近年来人类基因组计划和全基因组关联研究取得了重大进展,但由于人群基因学研究,尤其是家族基因学研究周期漫长、成本高昂以及相关伦理学和法律障碍,对AS和CAD的基因学研究进展缓慢。动物模型,尤其是小鼠模型的出现使相关研究取得重大突破。利用同为哺乳动物的小鼠基因组与人类基因组的高相似性,AS相关基因基础可以较快地在CAD高发鼠模型上被发现,为人类AS致病基因的发现提供根据和思路。到目前为止,许多AS相关致病基因已在小鼠模型上得到探明。然而,AS过程中巨噬细胞所发挥的作用是否与基因有关,巨噬细胞的脂质吞噬和脂质代谢是否由基因调控,导致巨噬细胞内脂质代谢紊乱的致病基因为何等问题尚未得到充分研究。目的根据CAD和AS多基因遗传特点,利用AS易感性差异巨大的AKR、DBA/2两家系小鼠的巨噬细胞脂质代谢表现型的不同,通过QTL定位、生物信息学和基因工程,探究巨噬细胞内脂质代谢紊乱与基因调控的相关性,探明导致巨噬细胞脂质代谢紊乱的基因学基础,加深对CAD的基因学认识,为心血管病预防和治疗提供新的思路和方向。方法1建立AKRxDBA/2杂交小鼠群组并进行QTL定位使用AKR/J和DBA/2J亲代小鼠交配,培育AKR x DBA/2子四代杂交小鼠,对子四代小鼠进行基因测序和骨髓来源巨噬细胞培养并检测其脂质代谢,获得子四代小鼠基因型和脂质代谢表现型的具体数据,之后使用R/qtl软件分析子四代小鼠的基因型和表现型数据,获得巨噬细胞脂质代谢表现型的QTL位点及该位点内相关基因,根据基因特性挑选出候选基因。2使用生物信息学探究候选基因Soatl基因在两家系间的差异通过对AKR和DBA/2 Soatl基因进行互补DNA PCR检测,发现两家系Soatl基因在转录水平的差异,根据转录水平差异使用Wellcome Trust Sanger Institue数据库调查两家系Soot1基因组序列差异。3使用CRISPR/Cas9技术编辑DBA/2干细胞Soat1基因无菌条件下培养小鼠多能干细胞,通过Nucleofection细胞核电穿孔法将带有Cas9蛋白质序列的质粒转染给该细胞,构建可以稳定表达Cas9蛋白的多能干细胞,然后根据CRISPR/Cas9工程原理,设计分别瞄定于AKR Sot1缺失片段两端的双向导RNA,并通过质粒转化和试管内转录合成此二向导RNA,最终通过细胞核穿孔转染实现CRISPR/Cas9系统在干细胞中的工作,完成对基因组中AKR Soat1缺失片段的删除。4基因编辑后干细胞定向分化为巨噬细胞通过生物信号诱导技术,对基因编辑后的干细胞进行定向分化,使其分化为巨噬细胞,并对分化后巨噬细胞进行脂质摄取功能检查,验证获得的干细胞来源巨噬细胞的功能完整性。5基因编辑后巨噬细胞功能和脂质代谢检测通过胆固醇质量检测技术和qPCR检测技术探测AKR Soot1缺失片段删除后巨噬细胞的脂质代谢和Soat1基因表达水平,并通过脂质染色技术发现基因编辑后巨噬细胞内的脂质蓄积情况,探究被编辑基因与巨噬细胞脂质代谢的关系。结果1 QTL定位结果:1.I与骨髓细胞来源巨噬细胞内脂质代谢表现型差异具有相关性的QTL位点共有10个,按基因顺序命名为Mcrrmm1-10。1.2 Mcmni1与两家系巨噬细胞内脂质代谢差异的相关性最强,包括两家系间游离胆固醇(R2=0.3;β=-23.4),胆固醇酯(R2=0.33;β=62.9)和游离胆固醇与胆固醇酯比值(R2=0.31;β=1.37)。2生物信息学研究发现:2.1 Mcmm1中包含34个基因,其中Soat1基因功能为酯化游离胆固醇为胆固醇酯,因此其被选择为第一候选基因。2.2两家系Soat1基因互补DNA方面,AKR比DBA/2缺失118bp的外显子2序列。2.3两家系Soat1基因基因组DNA方面,AKR比DBA/2缺失6818bp的位于 chr1:158,394,619-158,401,436 的基因片段。2.4两家系Soatl基因编码的乙酰辅酶A酰基转移酶方面,AKR比DBA/2缺失N端起始处的33个氨基酸。3基因编辑结果:3.1 Western Blot结果显示转染Cas9质粒并筛选后的干细胞株可以稳定表达Cas9蛋白。3.2 向导RNA基因检测结果显示设计的RNA序列成功整合入试管内转录的模板中,凝胶电泳结果显示试管内转录成功合成预期的向导RNA。3.3基因编辑后细胞池PCR凝胶电泳结果显示CRISPR/Cas9顺利工作,干细胞中的目标基因被按预期剪切。3.4采集细胞株的PCR凝胶电泳结果显示,成功获取基因编辑后的纯合子和杂合子细胞株。基因测序结果显示,获得的细胞株内目标基因按设计被成功编辑。4干细胞定向分化结果:4.1 Dil-acLDL摄取后荧光显微镜下结果显示经分化细胞为具备完整吞噬功能的巨噬细胞。4.2不同细胞系分化后脂质摄取流式细胞术结果显示,经过基因编辑的三系细胞分化结果无差异,均可分化为具备完成功能的巨噬细胞。5基因编辑后巨噬细胞检测结果:5.1 qPCR结果显示基因改造后的巨噬细胞mRNA水平未发生明显变化。5.2胆固醇检测结果显示,AKRSoat1缺失片段的删除使游离胆固醇升高,胆固醇酯降低及两者的比值下降,P<0.05。5.3脂质染色结果显示,AKRSoat1缺失片段的删除使巨噬细胞内胆固醇酯的蓄积减少。结论1 AKR与DBA/2家系巨噬细胞脂质代谢间的差异与10个QTL位点有关。2 10个QTL位点中的Mcmm1与巨噬细胞脂质代谢差异关联性最强。3 Mcmm1中编码乙酰辅酶A酰基转移酶的Soat1基因是与巨噬细胞脂质代谢差异有关的第一相关基因。4两家系Soat1基因在转录水平上,AKRSoat1基因存在118bp的外显子2缺失;在基因组水平上,AKR Soat1基因存在6.8kb的基因缺失;在翻译水平上,AKR乙酰辅酶A酰基转移酶N端存在33个氨基酸的缺失。5 AKR Soot1基因片段缺失与巨噬细胞脂质代谢表现型差异存在因果联系。