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人类免疫缺陷病毒-1型（Human Immunodeficiency Virus，HIV-1）属于逆转录病毒科慢病毒属，其基因组由两条单股正链RNA组成。目前由于该病毒在感染人体内极易发生变异，并具有复杂的免疫逃逸机制，因此仍没有有效的疫苗进行预防。HIV-1在宿主细胞内完成其复制过程大体需要以下几个环节：首先病毒囊膜蛋白与细胞表面的受体和辅佐受体结合、脱壳、逆转录形成双链cDNA进入细胞核、整合到宿主基因组、病毒基因的转录和剪切、病毒mRNA转运至细胞质、翻译病毒的结构蛋白和非结构蛋白、病毒粒子的出芽、成熟及释放等。HIV-1病毒在人体内需要借助大量的宿主因子完成其复制过程。
ANP32A和ANP32B均属于ANP32蛋白家族成员，其结构比较保守，N端为亮氨酸富集区，C端为酸性结构域。据报道ANP32A&B蛋白可以通过影响聚合酶的活性参与流感病毒的复制过程，而且可以促进逆转录病毒科中泡沫病毒RNA的核输出过程，但是其具体的机制以及对其它逆转录病毒的影响仍没有明确的报道。为了探索ANP32A&B在HIV-1复制中的作用，本研究首先利用CRISPR/Cas9技术构建了ANP32A和ANP32B单基因和双基因敲除的293T细胞系，分别命名为AKO、BKO和DKO。将表达VSV-G囊膜糖蛋白的质粒与囊膜蛋白缺失、表达荧光素酶（Luc）的人类免疫缺陷病毒I型（HIV-1）基因组的质粒共转染至四种细胞系中以包装HIV-1假病毒。收取细胞和病毒上清分别进行WB检测，结果显示AKO和BKO细胞系中P55和P24蛋白的表达与野生型相比没有明显的变化，而DKO细胞中的表达量明显低于WT细胞。同时在DKO细胞中单独补回ANP32A或者ANP32B的表达后Gag的表达量得到了明显的恢复。以上结果表明ANP32A和ANP32B在HIV-1病毒组装和Gag蛋白表达过程中具有重要作用。
为了进一步研究ANP32A&B影响HIV-1组装的作用机制，我们对HIV-1复制的关键环节依次进行检测。首先对HIV-1假病毒感染细胞后的早晚期逆转录产物和病毒mRNA的产量进行了荧光定量分析，结果显示ANP32A&B基因缺失对早晚期逆转录产物没有明显的变化，但是HIV-1gag mRNA的总量与野生型细胞相比降低10倍左右。对未完全剪切的和完全剪切的mRNA的核质比例进行荧光定量分析，结果显示DKO细胞中未完全剪切的gag mRNA主要集中在细胞核中，而在WT细胞中则主要集中在细胞质中。同时选取了完全剪切的tat mRNA进行检测，结果显示tat mRNA无论在WT还是DKO细胞中均主要位于细胞质中，该结果表明ANP32A&B可以特异性的影响未完全剪切mRNA的转运过程。此外，利用RNA Scope对gag mRNA进行细胞内定位分析，激光共聚焦和3D-SIM拍照结果均显示DKO细胞中mRNA几乎全部定位在细胞核中，而在野生型细胞中则主要位于细胞质中。
因为未完全剪切RNA的核输出过程是由Rev蛋白所介导的，我们进一步分析了ANP32A&B蛋白与Rev蛋白之间的相互作用，结果显示外源性的ANP32A&B以及内源性的ANP32B均能够与Rev蛋白发生相互作用，且Rev蛋白的RNA结合区以及ANP32B的亮氨酸富集区是Rev与ANP32B发生相互作用的关键结构域。此外，双分子荧光互补技术也证明ANP32与Rev能够在细胞核中发生相互作用。因为Rev蛋白结合含有RRE应答元件的RNA，为了研究ANP32A&B对含有RRE的RNA的作用机制，我们利用pDM628-RRE-luc和pDM628-4×CTE-luc进行荧光素酶RNA核质比例分析，结果显示含有RRE的RNA在DKO中细胞核的比例要高于WT细胞，但是对于依赖CTE的RNA在两种细胞中的核质比例则没有明显的变化，该结果表明ANP32A&B可以特异性的影响RRE介导的RNA核质转运过程。
最后，为了探索ANP32A&B是否参与CRM1依赖的核输出过程，我们利用Co-IP、Confocal和BiFC技术证明ANP32A&B能够与CRM1发生相互作用，主要定位在核膜上，且LMB处理后可以增强两者的相互作用。LMB是CRM1的抑制剂，抑制CRM1功能后HIV-1未剪切的mRNA被滞留在细胞核中。在WT细胞中我们发现加入LMB后细胞内P55表达量显著降低，在DKO细胞中ANP32A&B的缺失影响了P55的表达，然而LMB处理后P55的表达进一步降低。该结果表明ANP32A&B与CRM1蛋白共同促进病毒未完全剪切RNA的核输出过程。
综上所述，本研究首次报道了ANP32A&B在HIV-1复制过程中发挥关键性作用，可以通过影响Rev介导的未完全剪切mRNA的核质转运帮助蛋白的表达和病毒组装过程。
ANP32A和ANP32B均属于ANP32蛋白家族成员，其结构比较保守，N端为亮氨酸富集区，C端为酸性结构域。据报道ANP32A&B蛋白可以通过影响聚合酶的活性参与流感病毒的复制过程，而且可以促进逆转录病毒科中泡沫病毒RNA的核输出过程，但是其具体的机制以及对其它逆转录病毒的影响仍没有明确的报道。为了探索ANP32A&B在HIV-1复制中的作用，本研究首先利用CRISPR/Cas9技术构建了ANP32A和ANP32B单基因和双基因敲除的293T细胞系，分别命名为AKO、BKO和DKO。将表达VSV-G囊膜糖蛋白的质粒与囊膜蛋白缺失、表达荧光素酶（Luc）的人类免疫缺陷病毒I型（HIV-1）基因组的质粒共转染至四种细胞系中以包装HIV-1假病毒。收取细胞和病毒上清分别进行WB检测，结果显示AKO和BKO细胞系中P55和P24蛋白的表达与野生型相比没有明显的变化，而DKO细胞中的表达量明显低于WT细胞。同时在DKO细胞中单独补回ANP32A或者ANP32B的表达后Gag的表达量得到了明显的恢复。以上结果表明ANP32A和ANP32B在HIV-1病毒组装和Gag蛋白表达过程中具有重要作用。
为了进一步研究ANP32A&B影响HIV-1组装的作用机制，我们对HIV-1复制的关键环节依次进行检测。首先对HIV-1假病毒感染细胞后的早晚期逆转录产物和病毒mRNA的产量进行了荧光定量分析，结果显示ANP32A&B基因缺失对早晚期逆转录产物没有明显的变化，但是HIV-1gag mRNA的总量与野生型细胞相比降低10倍左右。对未完全剪切的和完全剪切的mRNA的核质比例进行荧光定量分析，结果显示DKO细胞中未完全剪切的gag mRNA主要集中在细胞核中，而在WT细胞中则主要集中在细胞质中。同时选取了完全剪切的tat mRNA进行检测，结果显示tat mRNA无论在WT还是DKO细胞中均主要位于细胞质中，该结果表明ANP32A&B可以特异性的影响未完全剪切mRNA的转运过程。此外，利用RNA Scope对gag mRNA进行细胞内定位分析，激光共聚焦和3D-SIM拍照结果均显示DKO细胞中mRNA几乎全部定位在细胞核中，而在野生型细胞中则主要位于细胞质中。
因为未完全剪切RNA的核输出过程是由Rev蛋白所介导的，我们进一步分析了ANP32A&B蛋白与Rev蛋白之间的相互作用，结果显示外源性的ANP32A&B以及内源性的ANP32B均能够与Rev蛋白发生相互作用，且Rev蛋白的RNA结合区以及ANP32B的亮氨酸富集区是Rev与ANP32B发生相互作用的关键结构域。此外，双分子荧光互补技术也证明ANP32与Rev能够在细胞核中发生相互作用。因为Rev蛋白结合含有RRE应答元件的RNA，为了研究ANP32A&B对含有RRE的RNA的作用机制，我们利用pDM628-RRE-luc和pDM628-4×CTE-luc进行荧光素酶RNA核质比例分析，结果显示含有RRE的RNA在DKO中细胞核的比例要高于WT细胞，但是对于依赖CTE的RNA在两种细胞中的核质比例则没有明显的变化，该结果表明ANP32A&B可以特异性的影响RRE介导的RNA核质转运过程。
最后，为了探索ANP32A&B是否参与CRM1依赖的核输出过程，我们利用Co-IP、Confocal和BiFC技术证明ANP32A&B能够与CRM1发生相互作用，主要定位在核膜上，且LMB处理后可以增强两者的相互作用。LMB是CRM1的抑制剂，抑制CRM1功能后HIV-1未剪切的mRNA被滞留在细胞核中。在WT细胞中我们发现加入LMB后细胞内P55表达量显著降低，在DKO细胞中ANP32A&B的缺失影响了P55的表达，然而LMB处理后P55的表达进一步降低。该结果表明ANP32A&B与CRM1蛋白共同促进病毒未完全剪切RNA的核输出过程。
综上所述，本研究首次报道了ANP32A&B在HIV-1复制过程中发挥关键性作用，可以通过影响Rev介导的未完全剪切mRNA的核质转运帮助蛋白的表达和病毒组装过程。