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目的：间质性肺疾病(Interstitial lung diseases， ILD)是结缔组织病(Connective tissue disease，CTD)如类风湿性关节炎(Rheumatoid arthritis，RA)最常见及最严重的并发症之一，近年来发病率及死亡率呈明显上升的趋势。激素与免疫抑制剂对这些病人的疗效欠佳。我们实验室先前的研究已经发现：介导炎症细胞因子受体信号通路的细胞浆酪氨酸激酶(Janus kinase3，JAK3)，是一个引起病理性固有免疫应答与炎症因子风暴的决定子,选择性JAK3抑制剂能减轻H5N1病毒抗原HA导致的肺免疫病理损伤。我们因而推测选择性JAK3抑制剂通过调节异常免疫炎症，可能在治疗自身免疫相关的肺纤维化疾病中发挥重要作用。在本研究中，我们采纳JAK3基因敲除鼠与新型的JAK3抑制剂CP-690550，对靶向JAK3在防治博莱霉素(Bleomycin，BLM)诱导的小鼠肺纤维化中的作用及其机制进行了研究。 方法：⑴将6-8周JAK3敲除的B6129S4-JAK3tmlLjb小鼠（JAK3-/-）及野生型(JAK3+/+) B6129SF2/J小鼠随机分为五组：JAK3+/++Saline、JAK3+/++博莱霉素、JAK3+/++博莱霉素+CP-690550、JAK3-/-+Saline、JAK3-/-+博莱霉素。博来霉素(3mg/kg)经小鼠气道内雾化制备肺纤维化模型。给予博莱霉素前一天，在野生型小鼠皮下植入胶囊渗透压泵(ALZET? Osmotic Pumps，＃2002)持续给予CP-690550（15mg/kg/d）或皮下植入假手术。给予博莱霉素第7、13、20天，处死小鼠并进行肺泡灌洗。检测肺泡灌洗液中细胞总数、细胞分类计数及总蛋白含量，并流式分析免疫细胞亚型。免疫组化及masson染色检测肺组织中CD3、α-SMA及胶原的表达。碱水解法检测肺组织中羟脯氨酸的含量。与此同时，在给予博莱霉素后的28天期间，观察各组小鼠的生存率与体重变化。⑵博来霉素给药后第7天、13天、20天，处死小鼠，行肺泡灌洗术及眼球取血采集血清及肺泡灌洗液，分离小鼠肺脏进行Western blot分析。液相芯片检测肺泡灌洗液及血清中细胞因子的表达水平；Western blot方法检测肺组织p-STAT3、p-ERK、p-Smad2、p-Smad3的表达。离体培养人肺泡上皮细胞（A549）及人正常的成纤维细胞(NLFB)，液相芯片分析CP-690550干预对细胞因子混合物Cytomix（TGF-β1、IL-1β、IFN-γ）刺激A549细胞后培养上清IL-6水平的影响，Western blot观察其干预在单独TGF-β1(5ng/ml)或同时给予IL-6(100ng/ml)刺激下，对NLFB表达间充质蛋白纤连蛋白(Fibronectin，Fn)的影响。 结果：①肺病理切片及肺泡灌洗液结果显示给予CP-690550治疗或JAK3基因缺失明显减轻了博莱霉素致小鼠肺部的炎症病理改变，伴随显著减少了肺泡灌洗液中蛋白含量及细胞总数。②气道给予博莱霉素后，7、13和20天的肺泡灌洗液中细胞分类显示，野生型小鼠肺部淋巴细胞持续维持在高水平，而给予CP-690550治疗或JAK3基因缺失小鼠的淋巴细胞的比例明显减少。免疫组化检测肺组织CD3的表达结果显示，给予CP-690550治疗或JAK3基因缺失明显抑制肺部T淋巴细胞的募集。应用CD3、CD8、CD4、CD25、Foxp3的特异性抗体标记肺泡灌洗液中的细胞并进行流式分析。与野生型小鼠相比，给予CP-690550治疗及JAK3基因缺失小鼠气道给予BLM后肺泡灌洗液中CD3+CD8+T的百分比较少；给予CP-690550治疗及JAK3基因缺失小鼠的肺泡灌洗液中没有检测到Treg。③肺病理切片显示：气道给予BLM的野生型小鼠肺部有大量的胶原沉积和伴随大量淋巴细胞浸润的肺间质区域有强阳性的α-SMA染色的典型纤维化病理改变，但这些改变并未在给予CP-690550治疗及JAK3基因缺失小鼠肺中发现。与野生型小鼠相比，经CP-690550治疗及JAK3基因缺失小鼠肺组织中羟脯氨酸的含量明显减少。④气道给予博莱霉素后第20天，给予CP-690550治疗小鼠及JAK3基因缺失小鼠生存率分别为：100％、84.6%，而野生型小鼠生存率仅有38.5%。体重变化曲线显示，野生型小鼠的体重明显持续下降，而给予CP-690550治疗及JAK3基因缺失小鼠的体重并无明显改变。⑤在气道给予博莱霉素的第7、13、21天，液相芯片检测肺泡灌洗液和血清中炎症及促纤维化的细胞因子动力学改变。我们发现给予博莱霉素早期(第7天)无论给予CP-690550治疗或否，肺泡灌洗液中IL-6及TGF-β1的表达水平均较正常对照上调，同时在给予CP-690550治疗的小鼠肺泡灌洗液中， IL-6及TGF-β1的表达水平高于未给予CP-690550治疗的野生型小鼠。我们观察发现：经CP-690550治疗的小鼠肺泡灌洗液中早期高表达的IL-6及 TGF-β1迅速恢复到正常水平。而未经CP-690550治疗的野生型小鼠的肺泡灌洗中IL-6及TGF-β1持续升高。JAK3基因缺失小鼠给予博莱霉素早期肺泡灌洗液中TGF-β1明显低于与野生型小鼠。⑥在博莱霉素损伤的早期，野生型小鼠血清中TGF-β1的水平比对照组及给予CP-690550治疗小鼠低，但其在后期显著升高。在急性期后，野生型小鼠血清中TGF-β1及IL-6的表达水平持续升高，但给予CP-690550治疗小鼠的TGF-β1及IL-6的表达水平迅速下降，且显著低于未接受CP-690550治疗小鼠。JAK3基因缺失小鼠的盐水对照组与博莱霉素组相比，血清中IL-6及TGF-β1的表达水平没有区别。⑦在给予博莱霉素损伤的晚期，野生型小鼠肺泡灌洗液中IP-10的表达水平明显下调，但经CP-690550治疗小鼠的IP-10水平没有显著变化。JAK3基因缺失小鼠肺泡灌洗液及血清中IP-10的表达水平均上调。在博莱霉素损伤早期，野生型小鼠血清中IFN-γ、IL-17A和IL-13的表达水平明显低于对照组，而给予CP-690550治疗小鼠的血清中IFN-γ、IL-17A和IL-13水平没有明显变化。⑧免疫印迹的结果表明，给予CP-690550治疗或JAK3基因缺失抑制了博莱霉素诱导的肺组织STAT3的高度磷酸化。博莱霉素诱导野生型小鼠或JAK3基因缺失小鼠肺部ERK1/2的磷酸化，但给予CP-690550治疗小鼠未见同样的改变。各组小鼠均没有观察到TGF-β1/Smad通路的活化。⑨液相芯片分析表明CP-690550能明显减少Cytomix(TGF-β1、IL-1β、IFN-γ)刺激A549细胞分泌IL-6，并能抑制细胞因子TGF-β1和IL-6诱导成纤维细胞纤连蛋白的过表达。 结论：⑴靶向JAK3或JAK3基因缺失抑制了免疫炎症细胞向肺内的募集，下调了细胞毒T细胞介导的自身免疫炎症，同时减少了T细胞介导的免疫抑制微环境，保护小鼠免受博莱霉素所致的急性肺损伤及纤维化。⑵研究揭示：JAK3发挥作为一个细胞因子受体激活核心增强子的作用，能够通过产生大量细胞因子增强固有免疫炎症反应，使免疫损伤诱导的促纤维化因子TGF-β1及IL-6持续性增加，因而高度活化了IL-6/STAT3信号转导，导致了博莱霉素损伤介导的进行性肺纤维化的发生发展。⑶研究结果提示：CP-690550可能在治疗自身免疫相关的肺纤维化疾病中具有重要的应用价值。