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平胸龟(Platysternon megacephalum)是平胸龟科现存唯一的代表种。基于数量性状的测量、形态学的分析以及地理分布情况,目前认为其包含3个亚种:中国亚种(P.m.megacephalum)、越南亚种(P.m.shiui)和缅甸亚种(P.m.peguens)。但是,形态学特征是随个体发育而不断变化的,存在一定的局限性,尤其是对于在分布区上有重叠的物种,因为潜在的物种间杂交可能导致难以有效区分的形态学特征。因此,有必要在分子水平上探究平胸龟三个亚种的有效性。 本研究采用特异 PCR技术,测序了平胸龟10只标本的线粒体控制区及其侧翼序列和14个核基因的DNA序列,探讨了平胸龟现存亚种的有效性。mt DNA控制区的比较结果显示,在缅甸亚种的TAS区5’端存在一个长130 bp的串联重复序列和一个 poly-C结构,在其他两个亚种中没有发现这2个特征;缅甸平胸龟 VNTRs区重复基序为 TATTA,而中国和越南亚种重复基序比较复杂,包括 TGTTA和 GTTGTTATATAATATAT。显示缅甸亚种与中国亚种、越南亚种间存在较大的差异。在此基础上,我们分别计算了三个亚种间 mt DNA控制区和14个核基因序列的平均遗传距离,并采用最大似然法(Maximum Likelihood, ML)和贝叶斯方法(Bayesian Inference, BI)构建了系统发生树。结果显示,缅甸亚种与(中国亚种+越南亚种)分歧显著,形成独立的一支且具有很高的支持率,平均遗传距离为0.093(mt DNA)和0.009(nu DNA),已达到种的分化水平。基于以上数据,我们建议将缅甸亚种提升为独立的种,命名为Platysternon peguense. 控制区(control region)是线粒体(mitochondrion, mt)DNA中最长的非编码区,包含参与 mt DNA复制和转录的调控元件。大多数后生动物的线粒体基因组中只含有一个控制区,但是越来越的研究显示在不同分类群的动物中,mt DNA中存在多个控制区(CRs)现象。本实验室前期的研究显示,平胸龟 mt DNA结构特殊,与典型的脊椎动物的mt DNA相比,包含了6个基因(tRNAHis/tRNASer/tRNALeu/nad5和 tRNAThr/tRNAPro)的重新排列,以及2个 CRs。这2个 CRs的序列有很高的相似度。前人对双控制区进化的研究表明,多数物种的双控制区是协同进化的(concerted evolution),但也有部分研究显示双控制区有多种进化模式。平胸龟的CRs是如何进化的迄今尚无研究报道。 我们从平胸龟分布地采集了22只样本,采用 Long-PCR和巢式 PCR(nestPCR)方法扩增了平胸龟 mt DNA双控制区序列,结合系统发生分析和重组检测分析,从微进化的水平上探讨了平胸龟 mt DNA双控制区的进化模式。采用临接法(Neighbor-Joining)、最大似然法(Maximum Likelihood, ML)和贝叶斯方法(Bayesian Inference, BI)构建双控制区(除 VNTRs)间的系统发生树,结果显示,在所有的聚类支中,来自不同个体的直系同源拷贝聚在一起,而来自同一个体的并系同源拷贝(CRⅠ和 CRⅡ)却没有聚在一起。这些结果表明,平胸龟双控制区可能是独立进化,而不是协同进化的。 此外,我们还发现在所构建的系统发生树中,T2的CRⅠ与 B支聚类,而 CRⅡ则与 C支发生聚类。结合核基因数据,我们证明了T2个体是缅甸亚种与越南亚种的杂交后代。基于此,我们推测平胸龟 mt DNA双控制区可能起源于异源重组。 利用 RDP软件,我们对获得的22只个体的双控制区序列进行了重组测试分析,结果显示,重组发生的位置位于420 bp和1080 bp处。在菲律宾犀鸟(Aceros waldeni)的mt DNA的TAS区存在一个复制叉屏障。经过序列比对分析,我们发现位于420 bp处的断裂点附近存在这个 RFB(replication forks barrier, RFB)的同源序列,可能与重组有关。此外,我们在 CRⅠ的第二断裂点(1080 bp)发现数目可变的串联重复序列(VNTRs),该序列存在亚种特异的长度和基序异质性,可能为重组的发生提供了序列基础。同时,我们还发现 CRⅡ的第二断裂点(1080 bp)下游的序列与珊瑚纲 mt Muts基因存在同源性,推测这段序列参与 CRⅡ及其侧翼 tRNA的修复。正是因为上述重组元件的存在,才保证平胸龟 CRs在独立进化过程中,序列保持高度相似,维持功能的稳定。 本研究首次利用分子生物学方法探讨了平胸龟现存3个亚种的有效性,基于遗传距离和系统发生分析结果,认为缅甸亚种与其他两个亚种分歧显著,建议提升为独立的种,并命名为 Platysternon peguense。另外,本研究在微进化的水平上,结合系统发生分析和重组检测分析方法,探讨了平胸龟 mt DNA双控制区的进化模式,结果表明平胸龟的mt DNA双控制区起源于异源重组,并独立进化。