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肺动脉高压(Pulmonary artery hypertension,PAH)以肺动脉压力升高为主要特征,其基本病理改变是肺血管舒缩功能的改变和肺血管重构。近年来,有关肺动脉高压发病机制、治疗策略的研究和开发逐渐成为基础和临床医学共同关注的热点。流行病学资料显示:高原动物和世居人较平原动物和人对缺氧环境具有更强的适应能力,这种现象的重要原因之一就是其肺血管对缺氧的收缩反应较弱,此即高原缺氧适应—习服机制之肺血管低反应性机制。由此,我们考虑,适度缺氧适应可能在某种程度上对于以肺血管舒缩功能改变为主要病理生理特征之一的肺动脉高压具有一定的遏制作用。慢性间歇性低压低氧(Chronic intermittent hypobaric hypoxia,CIHH)指人或动物在一定时间内间断暴露于低压低氧环境内(模拟高原环境低氧),而其余时间暴露于常氧环境。已有研究表明CIHH对包括心血管系统在内的机体的多种组织、器官具有保护作用,并表现抗高血压效应,但目前尚无CIHH对PAH作用的研究报道。本研究以野百合碱(Monocrotaline,MCT)诱导的大鼠肺动脉高压为模型观察CIHH对肺动脉高压的预防作用,并通过微血管张力测定、免疫组化、免疫荧光、流式细胞术、ELISA、Western blot和q PCR等方法从整体、器官、组织、细胞、分子和基因水平探讨CIHH预防MCT诱导肺动脉高压的可能机制,以验证我们的假说:CIHH可通过增强肺小动脉舒张发挥预防PAH作用。本研究分为三部分:(1)导管法测定肺血流动力学指标,观察CIHH对MCT诱导性PAH的预防作用;光镜观察肺组织和肺小动脉结构改变。(2)微血管张力测定法明确CIHH对大鼠肺小动脉舒缩活动的影响;检测e NOS和CYP2J2表达的变化,探讨CIHH对肺小动脉内皮依赖性舒张功能的影响;检测血管平滑肌BKCa通道表达的变化,探讨CIHH对肺小动脉非内皮依赖性舒张功能的影响;检测ki-67和ɑ-SM-actin表达的变化,探讨CIHH对肺小动脉平滑肌细胞增殖和表型转换进而对其收缩功能的影响。(3)ELISA法检测血清TNF-ɑ、IL-6及Western blot和q PCR法检测肺组织TNF-ɑ、IL-6表达的变化,流式细胞术检测外周血CD4+/CD8+T淋巴细胞以及脾脏CD3+T淋巴细胞凋亡率的变化,探讨CIHH对MCT诱导PAH预防作用的免疫调节机制;检测p-P38/p38MAPK、P65/Ik Bɑ表达的变化探讨CIHH对MCT诱导PAH预防作用的p38MAPK信号通路和NF-кB信号通路机制。第一部分慢性间歇性低压低氧对野百合碱诱导大鼠肺动脉高压的预防作用目的:明确CIHH对MCT诱导大鼠肺动脉高压的预防作用。方法:大鼠随机分为四组:正常对照组(CON)、肺动脉高压组(PAH)、间歇性低压低氧处理组(CIHH)、间歇性低压低氧预处理+肺动脉高压组(CIHH+MCT)。CIHH组大鼠置于低压低氧舱中,接受相当于海拔5000m高度、28天、每天6小时的低压低氧处理,其余时间置于常氧环境。PAH组大鼠单剂量腹腔注射MCT(60 mg/kg)14天后造成PAH模型。CIHH+MCT组接受28天的CIHH处理后单剂量腹腔注射MCT(60mg/kg),14天后进行实验。每周定时测量各组动物的体重和血压。导管法测定肺血流动力学指标,光镜下观察肺组织和肺小动脉结构的变化。结果:1.CIHH处理对正常大鼠基础血压、心率和体重无影响(P>0.05),但可对抗PAH大鼠心率的加快和体重的降低(P<0.05)。2.与CON组大鼠相比,PAH组大鼠m PAP显著升高(P<0.01);CIHH组、CIHH+MCT组大鼠m PAP与CON组大鼠无显著差异(P>0.05)。3.PAH组大鼠右心室肥厚指数(RVHI)明显高于其他三组大鼠(P<0.01);CON组、CIHH组、CIHH+MCT组大鼠之间RVHI无显著性差异(P>0.05)。4.组织切片光镜下可见,CIHH组和CON组大鼠肺动脉管壁结构清楚,厚度正常;PAH组大鼠肺小动脉管壁明显增厚,血管管腔狭窄甚至闭塞;CIHH+MCT组大鼠肺小动脉仅轻度增厚,程度明显轻于PAH组大鼠,血管管腔也无明显狭窄。CON组和CIHH组大鼠肺组织和肺血管周围无明显炎症细胞浸润;PAH组大鼠肺泡腔内巨噬细胞明显增多,肺小动脉周围单核/巨噬细胞浸润明显增多,血管周围炎症评分明显升高;而CIHH+MCT组大鼠肺泡腔内、肺小动脉周围单核/巨噬细胞明显少于PAH组大鼠,血管周围炎症评分亦明显偏低。与CON组大鼠相比较,PAH组大鼠肺动脉管壁厚度(MT%)显著增加(P<0.01),管腔面积(VA%)明显减小(P<0.01);CIHH+MCT组大鼠MT%较PAH组大鼠明显降低(P<0.01)而VA%明显升高(P<0.01)。小结:1.CIHH预处理能有效预防MCT诱导大鼠肺动脉高压的产生,改善右室肥厚程度及肺小动脉重构;2.CIHH预处理对MCT诱导大鼠肺动脉高压的预防作用可能与其抑制肺血管重构和免疫调节有关。第二部分慢性间歇性低压低氧对野百合碱诱导肺动脉高压大鼠肺动脉舒缩活动的影响目的:明确CIHH对MCT诱导肺动脉高压大鼠肺动脉收缩和舒张的影响并探讨其机制。方法:大鼠随机分为四组:正常对照组(CON)、肺动脉高压组(PAH)、间歇性低压低氧处理组(CIHH)、间歇性低压低氧预处理+肺动脉高压组(CIHH+MCT)。CIHH组大鼠置于低压低氧舱中,接受相当于海拔5000 m高度、28天、每天6小时的低压低氧处理,其余时间置于常氧环境。PAH组大鼠单剂量腹腔注射MCT(60 mg/kg)14天后造成PAH模型。CIHH+MCT组接受28天的CIHH处理后单剂量腹腔注射MCT(60mg/kg),14天后进行实验。每周定时测量各组动物的体重和血压。利用微血管环张力测定法分别观察PE诱导的肺动脉环收缩、ACh诱导的肺动脉内皮依赖性舒张和SNP诱导的肺动脉非内皮依赖性舒张。采用Western blot和q PCR方法检测肺动脉e NOS和CYP2J2表达的变化,探讨CIHH对肺动脉内皮依赖性舒张功能的影响;采用Western blot和q PCR方法检测血管平滑机BKCa通道表达的变化,探讨CIHH对肺动脉非内皮依赖性舒张功能的影响;采用免疫荧光方法检测肺动脉ki-67表达的变化,采用Western blot和q PCR方法检测肺动脉ɑ-SM-actin表达的变化,观察CIHH对肺动脉平滑肌细胞增殖和表型转换的改变进而探讨对其收缩功能的影响。结果:1.与CON组大鼠相比较,PAH组大鼠肺小动脉环内皮依赖性舒张反应降低(P<0.05),CIHH预处理可增加肺小动脉内皮依赖性舒张反应(P<0.05),并预防大鼠肺小动脉内皮依赖性舒张的降低(P<0.05)。2.与CON组大鼠相比较,PAH组大鼠肺小动脉环非内皮依赖性舒张反应降低(P<0.05),CIHH预处理可增加肺小动脉非内皮依赖性舒张反应(P<0.05),并预防大鼠肺小动脉非内皮依赖性舒张的降低(P<0.05)。3.与CON组大鼠相比较,PAH组大鼠肺小动脉环对PE反应性降低、收缩减弱(P<0.05);CIHH预处理可提高大鼠肺动脉对PE的收缩反应,对抗PAH大鼠肺动脉对PE收缩的减弱反应(P<0.05)。4.与CON组大鼠相比较:PAH组大鼠肺小动脉e NOS和CYP2J2表达下调(P<0.05),CIHH组大鼠e NOS和CYP2J2表达明显上调(P<0.01),CIHH预处理(CIHH+MCT组)可预防大鼠肺小动脉e NOS和CYP2J2下调(P<0.05)。5.与CON组大鼠相比较:PAH组大鼠肺小动脉ɑ-SM-actin和BKCa通道表达下调(P<0.05),CIHH组大鼠ɑ-SM-actin和BKCa通道表达上调(P<0.05),CIHH预处理(CIHH+MCT组)可预防大鼠肺小动脉ɑ-SM-actin和BKCa通道下调(P<0.05)。6.与CON组大鼠相比较:PAH组大鼠肺小动脉ki-67表达上调(P<0.05),CIHH预处理(CIHH+MCT组)可预防大鼠肺小动脉ki-67上调(P<0.01)。小结:1.CIHH预处理对MCT诱导性大鼠肺动脉高压的预防作用可能通过增强内皮依赖性和非内皮依赖性舒张、调节肺小动脉收缩所实现。2.CIHH预处理可能通过上调大鼠肺小动脉e NOS和CYP2J2表达,增强肺小动脉环内皮依赖性舒张。3.CIHH预处理可能通过上调大鼠肺小动脉血管平滑肌细胞BKCa通道表达,增强肺小动脉环非内皮依赖性舒张。4.CIHH预处理可上调ɑ-SM-actin表达,下调ki-67表达,从而可能通过抑制大鼠肺小动脉平滑肌细胞增殖和表型转换、调节肺小动脉环收缩功能。第三部分慢性间歇性低压低氧对野百合碱诱导大鼠肺动脉高压预防作用的免疫调节机制目的:探讨CIHH对MCT诱导大鼠肺动脉高压预防作用的免疫调节机制。方法:大鼠随机分为四组:正常对照组(CON)、肺动脉高压组(PAH)、间歇性低压低氧处理组(CIHH)、间歇性低压低氧预处理+肺动脉高压组(CIHH+MCT)。CIHH组大鼠置于低压低氧舱中,接受相当于海拔5000m高度、28天、每天6小时的低压低氧处理,其余时间置于常氧环境。PAH组大鼠单剂量腹腔注射MCT(60 mg/kg)14天后造成PAH模型。CIHH+MCT组接受28天的CIHH处理后单剂量腹腔注射MCT(60mg/kg),14天后进行实验。每周定时测量各组动物的体重和血压。采用ELISA和免疫组化方法检测血清和肺组织TNF-ɑ、IL-6表达的变化,采用流式细胞术测定外周血CD4+/CD8+T淋巴细胞比值以及脾脏CD3+T淋巴细胞凋亡率的变化;采用Western blot和q PCR方法从蛋白和基因水平检测p-P38/p38MAPK、p-P65/Ik Bɑ表达的变化,探讨CIHH对MCT诱导性大鼠肺动脉高压预防作用的信号通路机制。结果:1.与CON组大鼠相比较:PAH组大鼠外周血和肺组织TNF-ɑ、IL-6表达明显上调(P<0.01),CIHH预处理(CIHH+MCT组)可预防大鼠MCT诱导性TNF-ɑ、IL-6表达上调(P<0.01)。2.与CON组大鼠相比较:PAH组大鼠外周血CD4+T淋巴细胞水平明显升高、CD8+T淋巴细胞水平明显下降、CD4+/CD8+比值升高(P<0.05),脾脏CD3+T淋巴细胞凋亡率明显下降(P<0.01);CIHH组大鼠外周血CD4+T淋巴细胞水平下降、CD8+T淋巴细胞水平升高、CD4+/CD8+比值下降(P<0.01),脾脏CD3+T淋巴细胞凋亡率明显升高(P<0.01);CIHH预处理(CIHH+MCT组)可预防大鼠MCT诱导性CD4+升高、CD8+下降、CD4+/CD8+比值升高以及脾脏CD3+T淋巴细胞凋亡率下降(P<0.01)。3.与CON组大鼠相比较:PAH组大鼠肺组织p-P38表达明显上调、p38MAPK表达上调、p-P38/p38MAPK比值升高(P<0.01);CIHH组大鼠肺组织p-P38表达明显下调、p38MAPK表达下调、p-P38/p38MAPK比值降低(P<0.01);CIHH预处理(CIHH+MCT组)可预防大鼠MCT诱导性p-P38表达上调从而抑制p-P38/p38MAPK比值升高(P<0.01)。4.与CON组大鼠相比较:PAH组大鼠肺组织P65表达明显上调、Ik Bɑ表达明显下调、P65/Ik Bɑ比值升高(P<0.01);CIHH组大鼠血清P65表达明显下调、Ik Bɑ表达明显上调、P65/Ik Bɑ比值降低(P<0.01);CIHH预处理(CIHH+MCT组)可预防大鼠MCT诱导性P65表达上调、Ik Bɑ表达下调从而抑制P65/Ik Bɑ比值降低(P<0.01)。小结:1.CIHH预处理对MCT诱导大鼠肺动脉高压的预防作用可能与其抑制促炎因子TNF-ɑ、IL-6的产生和表达有关。2.CIHH预处理对MCT诱导大鼠肺动脉高压的预防作用可能与其维持T淋巴细胞增殖/凋亡平衡、抑制CD4+/CD8+亚群比例失调有关。3.CIHH预处理之抗MCT诱导大鼠肺动脉高压的免疫调节作用可能通其抑制p38MAPK信号通路和NF-кB信号通路的过度激活而实现。结论1.CIHH预处理对MCT诱导大鼠肺动脉高压具有明显的预防作用,此预防作用可能与其抑制肺小动脉重构和免疫调节作用有关。2.CIHH预处理可通过上调肺小动脉e NOS、CYP2J2及平滑肌细胞BKCa通道表达,增强肺小动脉内皮依赖和内皮非依赖舒张、对抗PAH大鼠肺小动脉舒张功能降低,预防肺动脉高压。3.CIHH预处理可通过下调ki-67表达和上调ɑ-SM-actin表达,抑制血管平滑肌病理性增殖和表型转换,预防肺动脉高压。4.CIHH预处理可通过p38MAPK信号通路和NF-кB信号通路抑制PAH大鼠肺小动脉促炎细胞因子升高、改善T淋巴细胞增殖/凋亡比例和CD4+/CD8+亚群比例失调,预防肺动脉高压。